من خلال استخدام التصوير الطيفي المجهري اثنين الفوتون النظام ، ويتم الحصول على بكسل المستوى خرائط لنقل الطاقة الرنين فورستر (الحنق) معربا عن كفاءات لخلايا مستقبلات الغشاء المفترضة لتشكيل هومو oligomeric المجمعات. من الحنق خرائط الكفاءة ، ونحن قادرون على تقدير متكافئة معلومات عن مركب قليل وحدات قيد الدراسة.
دراسة التفاعلات البروتين في الخلايا الحية مجالا هاما للبحث لأن المعلومات التي تراكمت فوائد التطبيقات الصناعية على حد سواء فضلا عن زيادات الأساسية المعرفة البيولوجية الأساسية. وقد فورستر للطاقة الرنين (الإسفار) نقل (الحنق) بين جزيء المانحة في حالة مثارة الكترونيا ومتقبل جزيء قريب تستخدم بشكل متكرر للدراسات من البروتين البروتين التفاعلات في الخلايا الحية. والموسومة البروتينات في المصالح مع نوعين مختلفين من تحقيقات الفلورسنت وأعرب في الخلايا البيولوجية. نحن متحمسون ثم تحقيقات الفلورسنت ، وعادة باستخدام أشعة الليزر ، ويتم جمع الخصائص الطيفية من الانبعاثات الصادرة عن مضان تحقيقات الفلورسنت وتحليلها. يتم تضمين المعلومات المتعلقة درجة التفاعل البروتين في بيانات الانبعاثات الطيفية. عادة ، يجب أن تفحص الخلية عددا من المرات من أجل تجميع المعلومات الطيفية كافية لتحديد دقيق لمدى التفاعل البروتين لكل منطقة من المصالح داخل الخلية. ومع ذلك ، قد التكوين الجزيئي لتغيير هذه المناطق خلال عملية الاستحواذ ، مما يحد من عزم المكانية من القيم الكمية للكفاءات الحنق على ما يبدو الى ما معدله أكثر من الخلايا بأكمله. عن طريق الميكروسكوب ثنائي الفوتون الطيفي ، ونحن قادرون على الحصول على مجموعة كاملة من الصور الطيفي واحد فقط بعد فحص الإثارة الكاملة للعينة من الفائدة. من هذه البيانات بكسل المستوى الطيفي ، وخريطة لالحنق وتحسب الكفاءة في جميع أنحاء الخلية. من خلال تطبيق نظرية بسيطة من الحنق في المجمعات oligomeric للتوزيع التي تم الحصول عليها تجريبيا من الحنق الكفاءة في جميع أنحاء الخلية ، وهو واحد تفحص الطيفي يكشف عن معلومات حول القياس المتكافئ والهيكلية المعقدة قليل وحدات قيد الدراسة. نحن هنا وصف الإجراء إعداد الخلايا البيولوجية (خميرة السكيراء الخميرة) معربا عن غشاء المستقبلات (2 العقيمة α مستقبلات عامل) الموسومة مع نوعين مختلفين من تحقيقات الفلورسنت. علاوة على ذلك ، نحن لتوضيح العوامل الحاسمة التي ينطوي عليها جمع البيانات مضان الطيفي باستخدام التصوير المجهري اثنين الفوتون النظام. ويجوز تمديد استخدام هذا البروتوكول لدراسة أي نوع من البروتين الذي يمكن التعبير عنه في الخلية الحية مع علامة فلوري مرفقة به.
في هذا العرض ، ويتضح لنا كيفية تحديد حجم والمعلومات حول الهيكلية بروتين قليل وحدات معقدة في الجسم الحي. في حين تم الحصول على البيانات المقدمة من الغشاء مستقبلات محددة (أي Ste2p) التي أعرب عنها في خلايا الخميرة ، فإن هذه الطريقة تشمل كل ما في ويمكن تطبيقه على أي نوع م?…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من مبادرة بحوث النمو يسكونس ميلووكي ، ويسكونسن لمعهد الطب الحيوي والتكنولوجيا والصحة ، ومؤسسة برادلي.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Peptone | Fisher Scientific | BP1420 | ||
Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 | ||
Polyethlyene Glycol 4000 | Hampton Research | HR2-605 | ||
Yeast Nitrogen Base w/o (NH4)2SO4 and amino acids | Fisher Scientific | DF0335-15-9 | ||
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | Sigma Aldrich | Y2001 | ||
D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | ||
Agar | Fisher Scientific | S70210 | ||
Ammonium Sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | ||
Potassium Chloride | Acros Organics | 424090010 | ||
Leucine | Fisher Scientific | BP385 | ||
Histidine | Fisher Scientific | BP382 | ||
Plan Achromat Infinity Corrected 100x Oil Immersion Objective NA=1.43 | Nikon | |||
Spectrally resolved two photon microscope |