Door het gebruik van een spectraal opgelost twee-foton microscopie imaging-systeem, zijn pixel-niveau kaarten van Förster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiëntie verkregen voor cellen die membraanreceptoren verondersteld dat homo-oligomere complexen vormen. Van de efficiëntie kaarten FRET, we zijn in staat om stoichiometrisch informatie over het oligomeer complex schatting in studie.
De studie van eiwit interacties in levende cellen is een belangrijk gebied van onderzoek, omdat de informatie verzameld zowel voordelen industriële toepassingen alsmede verhogingen elementaire fundamentele biologische kennis. Förster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) tussen een donor molecuul in een elektronisch aangeslagen toestand en een nabijgelegen acceptor molecuul is vaak gebruikt voor studies van eiwit-eiwit interacties in levende cellen. De eiwitten van belang zijn gelabeld met twee verschillende types van fluorescerende probes en uitgedrukt in biologische cellen. De fluorescerende probes worden dan enthousiast, meestal met behulp van laserlicht, en de spectrale eigenschappen van de fluorescentie-emissie afkomstig van de fluorescerende probes is verzameld en geanalyseerd. Informatie over de mate van het eiwit interacties is ingebed in de spectrale emissie-gegevens. Typisch, moet de cel worden gescand een aantal keren in om voldoende spectrale informatie verzamelen om nauwkeurig kwantificeren van de omvang van het eiwit interacties voor elke regio van belang binnen de cel. Echter, de moleculaire samenstelling van deze regio's te veranderen in de loop van de acquisitie-proces, het beperken van de ruimtelijke bepaling van de kwantitatieve waarden van de schijnbare FRET efficiëntie tot een gemiddelde over heel cellen. Door middel van een spectraal opgelost twee-foton microscoop, zijn wij in staat om een volledige set van spectraal opgelost beelden te verkrijgen na slechts een volledig excitatie scan van de steekproef van belang. Uit dit pixelniveau spectrale data, een kaart van FRET efficiëntie in de cel wordt berekend. Door het toepassen van een eenvoudige theorie van FRET in oligomere complexen aan de experimenteel verkregen verdeling van de FRET efficiëntie in de cel, een enkele spectraal opgelost scan onthult stoichiometrische en structurele informatie over het oligomeer complex onder te bestuderen. Hier beschrijven we de procedure voor de voorbereiding van biologische cellen (de gist Saccharomyces cerevisiae) uiten van membraan receptoren (steriele twee α-factor receptoren) gelabeld met twee verschillende types van fluorescerende probes. Daarnaast illustreren we kritische factoren die betrokken zijn bij het verzamelen van gegevens met behulp van fluorescentie de spectraal opgelost twee-foton microscopie imaging systeem. Het gebruik van dit protocol kan worden uitgebreid tot elk soort eiwit dat kan worden uitgedrukt in een levende cel met een fluorescente marker in bijlage aan het bestuderen.
In deze presentatie, we geïllustreerd hoe de grootte en de structurele informatie over een eiwit oligomeer complex in vivo te bepalen. Terwijl gepresenteerde gegevens werden verkregen uit een specifiek membraan receptor (dwz Ste2p) uitgedrukt in gistcellen, de methode is allesomvattend in dat het kan worden toegepast op elk soort eiwit, uitgedrukt in elk type cel, de enige bepaling is dat de eiwitten zijn voorzien van tag met de juiste fluorescerende markers. Toekomstige wijzigingen van dit protocol zal omvatt…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de UW-Milwaukee Research Groei-initiatief, de Wisconsin Instituut voor Biomedische Technologie en Gezondheid, en de Bradley Foundation.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Peptone | Fisher Scientific | BP1420 | ||
Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 | ||
Polyethlyene Glycol 4000 | Hampton Research | HR2-605 | ||
Yeast Nitrogen Base w/o (NH4)2SO4 and amino acids | Fisher Scientific | DF0335-15-9 | ||
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | Sigma Aldrich | Y2001 | ||
D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | ||
Agar | Fisher Scientific | S70210 | ||
Ammonium Sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | ||
Potassium Chloride | Acros Organics | 424090010 | ||
Leucine | Fisher Scientific | BP385 | ||
Histidine | Fisher Scientific | BP382 | ||
Plan Achromat Infinity Corrected 100x Oil Immersion Objective NA=1.43 | Nikon | |||
Spectrally resolved two photon microscope |