על ידי שימוש לפתור spectrally שני הפוטונים מערכת הדמיה מיקרוסקופית, פיקסל ברמה מפות של העברת אנרגיה תהודה פורסטר (סריג) יעילות מתקבלים עבור תאים להביע את קולטני קרום השערה כדי ליצור הומו-oligomeric קומפלקסים. מן סריג מפות יעילות, אנו מסוגלים להעריך מידע stoichiometric על המתחם oligomer תחת מחקר.
המחקר של אינטראקציות חלבון בתאים חיים הוא אזור חשוב של המחקר, כי המידע שהצטבר הן הטבות יישומים תעשייתיים כמו גם מגדיל בסיסי ידע ביולוגי בסיסי. פורסטר (הקרינה) תהודה העברת אנרגיה (סריג) בין מולקולת התורם במצב נרגש אלקטרונית מולקולה acceptor הסמוכים נוצל לעתים קרובות ללימודים של חלבונים אינטראקציות בתאים חיים. החלבונים של עניין מתויגים עם שני סוגים שונים של בדיקות ניאון והביע בתאים ביולוגיים. בדיקות פלורסנט שמחים אז, בדרך כלל באמצעות אור לייזר, ואת המאפיינים הרפאים של פליטת הקרינה הנובעות בדיקות ניאון הוא לאסוף ולנתח. מידע בדבר מידת האינטראקציות חלבון מוטבע נתוני פליטה ספקטרליים. בדרך כלל, התא חייב להיות סרק מספר פעמים על מנת לצבור מידע ספקטרלי מספיק כדי לכמת במדויק את היקף האינטראקציות חלבון עבור כל אזור של אינטרס בתוך התא. עם זאת, את ההרכב המולקולרי של אזורים אלה עשויים להשתנות במהלך תהליך הרכישה, להגביל את הנחישות המרחבית של ערכים כמותיים של סריג היעילות לכאורה בממוצע על פני התאים כולו. באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים spectrally נפתר, אנו מסוגלים להשיג סט מלא של תמונות נפתרה spectrally לאחר הסריקה אחד בלבד להשלים עירור של המדגם של עניין. מכאן פיקסל ברמה נתונים ספקטרליים, מפה של סריג יעילות ברחבי התא מחושב. על ידי יישום תיאוריה פשוטה של סריג מתחמי oligomeric חלוקת שהושגו בניסוי של סריג יעילות ברחבי התא, סריקה החליט spectrally אחד מגלה מידע stoichiometric מבניים על המתחם oligomer תחת מחקר. כאן אנו מתארים את הליך הכנת תאים ביולוגיים (cerevisiae Saccharomyces שמרים) להביע את קולטני קרום (סטרילי 2 α גורם קולטנים) מתוייגים עם שני סוגים שונים של בדיקות ניאון. יתר על כן, אנו ממחישים הגורמים הקריטיים המעורבים באיסוף נתונים באמצעות פלואורסצנציה החליטה spectrally שני הפוטונים מערכת הדמיה במיקרוסקופ. השימוש בפרוטוקול זה ניתן להאריך ללמוד כל סוג של חלבון אשר יכול לבוא לידי ביטוי בתא חי עם סמן פלואורסצנטי קשור אליו.
במצגת זו, הדגמנו כיצד לקבוע את גודל מידע מבניים מורכבים על חלבון oligomer in vivo. בעוד הנתונים שהוצגו התקבל קולטן קרום מסוים (כלומר Ste2p) הביע בתאי שמרים, השיטה היא חובקת כל בכך שהוא יכול להיות מיושם על כל סוג של חלבון לידי ביטוי לכל סוג של תא, התנאי היחיד הוא בכך את החלבונ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי יוזמת UW-מילווקי המחקר צמיחה, המכון ויסקונסין ביו טכנולוגיות הבריאות, קרן ברדלי.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Peptone | Fisher Scientific | BP1420 | ||
Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 | ||
Polyethlyene Glycol 4000 | Hampton Research | HR2-605 | ||
Yeast Nitrogen Base w/o (NH4)2SO4 and amino acids | Fisher Scientific | DF0335-15-9 | ||
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | Sigma Aldrich | Y2001 | ||
D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | ||
Agar | Fisher Scientific | S70210 | ||
Ammonium Sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | ||
Potassium Chloride | Acros Organics | 424090010 | ||
Leucine | Fisher Scientific | BP385 | ||
Histidine | Fisher Scientific | BP382 | ||
Plan Achromat Infinity Corrected 100x Oil Immersion Objective NA=1.43 | Nikon | |||
Spectrally resolved two photon microscope |