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Biology

Indução e pontuação clínica de doenças crônico-recidivante encefalomielite autoimune experimental

doi: 10.3791/224 Published: July 4, 2007

Summary

Este vídeo demonstra o placar de indução e clínicos de um modelo animal de esclerose múltipla: doenças crônico-recidivante encefalomielite autoimune experimental em ratos DA. A doença, induzida pela imunização ratos com uma emulsão contendo medula espinhal de ratos inteiros e adjuvante de Freund completo, apresenta sinais clínicos semelhantes à doença humana.

Abstract

Esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória crônica do sistema nervoso central (SNC), que comumente afeta adultos jovens. É caracterizada por desmielinização e assustando glial em áreas disseminadas no cérebro e medula espinhal. Essas lesões alterar a condução nervosa e induzir a déficits neurológicos incapacitantes que variam com a localização das placas de desmielinização no SNC (por exemplo, paraparesia, paralisia, cegueira, incontinência).

Encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo para MS. EAE foi induzida acidentalmente em humanos durante a vacinação contra a raiva, usando vírus cultivados em coelho medula espinhal. Resíduos de injeção espinhal com o vírus inativado induziram a doença do SNC. Seguindo essas observações, o primeiro modelo da EAE foi descrita em primatas não-humanos imunizados com um CNS homogeneizado por Rivers e Schwenther em 1935. EAE desde então tem sido gerada em uma variedade de espécies e pode seguir cursos diferentes, dependendo da espécie / estirpe e imunizando antígeno utilizado. Por exemplo, imunizando ratos Lewis com proteína básica da mielina em emulsão com adjuvante induz um modelo aguda da EAE, enquanto o mesmo antígeno induz a uma doença crônica em cobaias.

O modelo de EAE aqui descrito é induzida através da imunização contra ratos DA DA medula espinhal de ratos em emulsão em adjuvante de Freund completo. Ratos desenvolvem uma paralisia flácida ascendente dentro de 7-14 dias pós-imunização. Sinais clínicos seguir um curso remitente-recorrente durante várias semanas. Patologia mostra grandes infiltrados imunológico no SNC e placas de desmielinização. Considerações especiais para cuidar de animais com EAE são descritos no final do vídeo.

Protocol

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Indução e monitorização de EAE crónica recidivante

A emulsão é uma mistura 1:1 do antígeno em solução aquosa adicionado ao complementada adjuvante de Freund completo. É muito importante adicionar o antígeno ao adjuvante e não o contrário!

Há uma grande quantidade de resíduos ao fazer e injetando uma emulsão. Sempre preparar 1,5 ou 2 vezes mais do que o que você precisa.

Use argamassa autoclavado, pilão, seringas de vidro, e pontes. Todos os plásticos devem ser estéreis. A preparação pode ser feito em uma bancada de laboratório regular.

1. Preparação do adjuvante complementado

Pesar 30 mg de Mycobacterium tuberculosis (Difco catalogo 231.141) e coloque em um pilão. Transformar em pó fino sem pressionar demasiado duro para evitar quebrar as bactérias. Adicionar 10 ml de adjuvante completo de Freund H37Ra (Difco catalogo 231.131) e misturar. Este adjuvante complementada agora contém 4 mg / ml Mycobacterium tuberculosis. Transferir para um tubo.

2. Preparação do homogenato medula espinhal

Coletar medula espinhal de ratos DA (idade / sexo indiferente) e armazenar congelado a -80 ° C. Pesar os cabos congelados espinhal para ter o suficiente para mistura 1:1 (peso: volume) com o adjuvante suplementado. Picar a medula espinhal mais fino possível com uma lâmina de barbear, a transferência para a argamassa usada na seção 1, e fazer um colar com o pilão.

3. Preparação da emulsão

  1. Lugar complementada completa adjuvante de Freund em um tubo. Vortex em alta velocidade. Adicionar a queda da medula espinhal homogeneizado a gota enquanto vórtex. Quando todos os homogeneizado medula espinhal é adicionada vórtice, por mais 5 minutos. A mistura deve virar rosa claro.

  2. Coloque a emulsão em uma seringa de vidro de 5 ml e vinculá-lo para outra seringa de vidro 5 ml usando uma ponte de 18G (Fisher catálogo # 14-825-17L). Enviar a emulsão de uma seringa para o outro até que se torne rígido (5-10 min). Se mais de 5 ml de emulsão é preparada, use várias seringas 5 ml NÃO use seringas maiores.

  3. A emulsão pode ser armazenada nas seringas a 4 ° C por 3 semanas. Eu recomendo prepará-la pelo menos 12 horas de antecedência para verificar se ele não quebrar. Ele deve permanecer espessa e não separados em duas fases. A cor irá mudar durante a noite para uma luz amarela ou bege.

4. Imunização dos ratos

  1. Misture a emulsão nas seringas por alguns minutos e transfira para a seringa utilizada para a injeção. Injetar 200 mL por via subcutânea na própria base da cauda usando agulhas 23G e 3 ml seringas Luer-Lock em curto prazo anestesia.

  2. Os destinatários são 7-9 semanas de idade ratas DA. Ficamos com nossos ratos de Harlan Sprague Dawley-.

  3. Ratos devem ser observadas duas vezes por dia e pesados ​​diariamente. Os sinais clínicos são esperados 7-15 dias após a injeção da emulsão.

Pontuação clínica:

0: sem doença

0.5: cauda limp distal

Um: tail limp

2: paraparesia leve, ataxia

3: paraparesia moderada, as viagens ratos de vez em quando

3.5: um dos membros posteriores é paralisado, os outros movimentos

4: paralisia de membros posteriores completo

5: paralisia de membros posteriores e completa incontinência

6: dificuldade em respirar moribunda, não comer ou beber. Euthanize imediatamente.

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Discussion

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Há algumas considerações importantes para este protocolo.

Genética de ratos DA diferem ligeiramente dependendo do criador, elas são compradas a partir de. Estas diferenças podem aumentar ou diminuir a susceptibilidade dos ratos à EAE de indução. Se o seu ratos são mais suscetíveis a EAE você vai querer reduzir a força da imunização usando não suplementadas adjuvante de Freund completo ou mesmo incompleta adjuvante de Freund. Você também pode considerar a redução da quantidade de emulsão injetada ou diluir o homogeneizado da medula espinhal com solução salina antes de preparar a emulsão. Se o seu ratos não desenvolvem sinais clínicos da EAE usando a força total imunizar emulsão verificar a limpeza das suas instalações de habitação. Ratos infectados com parasitas (como pinworm) não irão desenvolver EAE. Você pode considerar a habitação seus animais em condições mais limpas em gaiolas com filtro autoclavado-tops, e dando-lhes acidificados água ad libitum (o protocolo para a elaboração água acidificada é anexado).

A emulsão deve ser água em óleo, de modo que o óleo no adjuvante casaco completamente o antígeno você adicionar gota a gota. Uma emulsão preparada de outra maneira (óleo-em-água) vai se tornar tão espessa, mas não será encephalitogenic.

Os ratos são animais amigáveis, se eles estão acostumados ao seu manipulador, é, portanto, uma boa idéia para segurá-los delicadamente em uma base diária antes da injeção da emulsão encephalitogenic. Isso irá reduzir o estresse eo risco de uma mordida.

Animais com EAE grave (escore de 3 ou mais) precisam de cuidados especiais. Ratos nunca deve ser pego pelo rabo, mas sim pelo corpo. Isto é ainda mais importante para reduzir o estresse em animais doentes. É muito importante assegurar que todos os animais têm acesso a alimentos e água, colocando pacotes de comida e gel na cama e proporcionando longa sipper tubos nas garrafas de água. Ratos com EAE continuarão comendo e bebendo, se uma paragem de animais ou de comer ou beber consultar o veterinário do seu instituto ou eutanásia do animal. Ratos doentes devem ser separados dos animais saudáveis ​​para garantir que eles não estão constantemente espezinhados, mas evite ratos deixando sozinha uma vez que são animais sociais e precisam de companhia.

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Disclosures

CB e KGC são co-fundadores e consultores para Airmid Inc.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Complete Freund’s Adjuvant Reagent Fisher Scientific DF 311-360-5 Manufactured by Difco
Mycobacterium tuberculosis H37Ra Reagent Fisher Scientific DF3114-33-8 Manufactured by Difco
DA rat Animal Harlan Laboratories Females, 7-9 weeks old.
Glass syringes - 5 ml Tool Fisher Scientific 14-823-10 B
Metal bridge - 18G Tool Fisher Scientific 14-825-17L
Luer Lok plastic syringes - 3 ml Tool BD Biosciences 309585
Needles - 20G 1 1/2 Tool Fisher Scientific 14-826-5C

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Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Induction and Clinical Scoring of Chronic-Relapsing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (5), e224, doi:10.3791/224 (2007).More

Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Induction and Clinical Scoring of Chronic-Relapsing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (5), e224, doi:10.3791/224 (2007).

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