Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Induktion och klinisk Poängsättning av kronisk Skovvis Experimentell Autoimmun Encephalomyelitis

doi: 10.3791/224 Published: July 4, 2007

Summary

Denna video visar induktion och kliniska poängsättning av en djurmodell av multipel skleros: kronisk skovvis experimentell autoimmun encefalomyelit i Da råttor. Sjukdomen, som induceras av vaccinera råttor med en emulsion som innehåller hela råtta ryggmärgen och fullständig Freunds adjuvans presenterar kliniska symtom som liknar den mänskliga sjukdomen.

Abstract

Multipel skleros (MS) är en kronisk inflammatorisk sjukdom i centrala nervsystemet (CNS) som brukar drabbar unga vuxna. Det kännetecknas av demyelinisering och gliaceller skrämma i områden som sprids i hjärnan och ryggmärgen. Dessa skador ändra nervledningen och förmå handikappande neurologiska bortfall som varierar med placeringen av demyelinated plack i CNS (t ex parapares, förlamning, blindhet, inkontinens).

Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) är en modell för MS. EAE först inducerad misstag på människor under vaccination mot rabies, med hjälp av virus som odlas på kanin ryggmärgen. Rester av spinal sprutas med inaktiverat virus inducerade CNS-sjukdom. Efter dessa observationer, var en första modell av EAE som beskrivs i icke-mänskliga primater immuniserade med CNS homogenatet av floder och Schwenther 1935. EAE har sedan genererat i en mängd olika arter och kan följa olika kurser beroende på art / stam och vaccinera antigen som används. Till exempel vaccinera Lewis råttor med myelin grundläggande protein i emulsion med adjuvans framkallar en akut modell av EAE, medan samma antigen inducerar en kronisk sjukdom hos marsvin.

Det EAE modell som beskrivs här är framkallas av vaccinera DA råttor mot DA råtta ryggmärgen i emulsion i fullständig Freunds adjuvans. Råttor utveckla en uppåtstigande slapp förlamning inom 7-14 dagar efter vaccination. Kliniska tecken följer en skovvis förlöpande kurs över flera veckor. Patologi visar stora immun infiltrerar i CNS och plack demyelinisering. Särskilda överväganden för att ta hand om djur med EAE beskrivs i slutet av videon.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Induktion och övervakning av kronisk skovvis EAE

Emulsionen är en 1:1 blandning av antigen i vattenlösning tillsätts kompletteras komplett Freunds adjuvans. Det är mycket viktigt att lägga antigen i adjuvant och inte tvärtom!

Det finns en hel del avfall när de gör och injicerar en emulsion. Alltid förbereda 1,5 eller 2 gånger mer än vad du behöver.

Använd autoklaveras murbruk, mortel, sprutor glas och broar. Alla plaster bör vara sterila. Preparatet kan göras på en vanlig laboratorium bänk.

1. Beredning av kompletterad adjuvant

Väg 30 mg av Mycobacterium tuberculosis (Difco katalog # 231.141) och placera i en mortel. Gör i tunna pulver utan att trycka för hårt för att undvika att bryta mot bakterier. Tillsätt 10 ml av kompletta Freunds adjuvans H37Ra (Difco katalog # 231.131) och blanda. Detta kompletteras adjuvans innehåller nu 4 mg / ml Mycobacterium tuberculosis. Överför till ett rör.

2. Beredning av ryggmärgen homogenatet

Samla ryggmärg från DA råttor (ålder / kön likgiltig) och lagra frysta vid -80 ° C. Väg frysta ryggmärgen att ha tillräckligt att blanda 1:1 (vikt: volym) med tillägg adjuvans. Finhacka ryggmärg så fint som möjligt med ett rakblad, transfer till murbruk används i avsnitt 1, och göra en pasta med mortelstöt.

3. Beredning av emulsion

  1. Placera kompletteras komplett Freunds adjuvans i ett rör. Vortex i hög hastighet. Lägg till ryggmärgen homogenatet droppvis medan vortexa. När alla i ryggmärgen homogenatet läggs virvel i 5 minuter. Blandningen ska vända ljusrosa.

  2. Sätt emulsion i en 5 ml glasspruta och länka den till en annan 5 ml glasspruta med en 18G bro (Fisher katalog # 14-825-17L). Skicka emulsionen från spruta till den andra tills det blir svårt (5-10 min). Om mer än 5 ml emulsion är beredd, använda flera olika 5 ml sprutor INTE använder större sprutor.

  3. Emulsionen kan förvaras i sprutorna vid 4 ° C i 3 veckor. Jag rekommenderar att förbereda det minst 12 timmar i förväg för att kontrollera att det inte bryts ner. Det bör vara tjock och inte separata i 2 faser. Färgen kommer att förändras över en natt till en ljus gul eller beige.

4. Immunisering av råttorna

  1. Blanda emulsionen i sprutor under några minuter och transfer till sprutan som används för injektionen. Injicera 200 l subkutant i själva svansroten med 23G nålar och 3 ml luer-lock sprutor under kortfristiga anestesi.

  2. Mottagarna är 7-9 veckor gamla tik DA råttor. Vi får våra råttor från Harlan-Sprague Dawley.

  3. Råttor bör observeras två gånger dagligen och vägde dagligen. Kliniska tecken förväntas 7-15 dagar efter injektion av emulsionen.

Kliniska poängsättning:

0: ingen sjukdom

0,5: distala halta svans

1: halta svans

2: mild parapares, ataxi

3: måttlig parapares, råttorna resor från tid till

3,5: en bakbenen är förlamad, det andra rör sig

4: kompletta bakbenen förlamning

5: komplett bakbenen förlamning och inkontinens

6: döende, svårighet att andas, inte äta eller dricka. Euthanize omedelbart.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Det finns några viktiga överväganden för detta protokoll.

Genetik av DA råttor kommer skilja sig något beroende på vilken uppfödare de är köpt från. Dessa skillnader kan öka eller minska känsligheten hos råttor EAE induktion. Om dina råttor är mer mottagliga för EAE du kommer att vilja minska styrkan i immunisering genom att använda icke-kompletterade komplett Freunds adjuvans eller ofullständiga Freunds adjuvans. Du kan också överväga att minska mängden emulsion injiceras eller spädning av ryggmärgen homogenatet med koksaltlösning innan man förbereder emulsionen. Om dina råttor utvecklar inte kliniska tecken på EAE med full styrka vaccinera emulsion kontrollera städningen av din bostad anläggning. Råttor infekterade med parasiter (t.ex. springmask) kommer inte att utveckla EAE. Du kan överväga bostäder dina djur under renare förhållanden i autoklaveras burar med filter-toppar, och ge dem syrad libitum vatten annons (protokollet för att förbereda försurade vatten är anslutet).

Emulsionen måste vara vatten-i-olja, så att oljan i adjuvant pälsen helt antigenet du lägger droppvis. En emulsion beredd tvärtom (olja-i-vatten) kommer att bli så tjock men kommer inte att encephalitogenic.

Råttor är vänliga djur om de är vana vid att deras förare är det därför en bra idé att hantera dem försiktigt på en daglig basis före injektion av encephalitogenic emulsion. Detta kommer att minska stress och risken för ett bett.

Djur med svår EAE (betyg 3 eller fler) behöver särskild vård. Råttor ska aldrig plockas i svansen utan snarare av kroppen. Detta är ännu viktigare för att minska stress hos sjuka djur. Det är mycket viktigt att se till att alla djur har tillgång till mat och vatten genom att sätta mat och gel förpackningar i sängar och ge lång sipper rör på vattenflaskor. Råttor med EAE kommer att fortsätta att äta och dricka, om ett djur sluta antingen äta eller dricka kontakta din institutets veterinär eller avliva djuret. Sjuka råttor bör separeras från friska djur så att de inte ständigt trampade, men undvik att lämna råttor ensamma eftersom de är sociala djur och behöver sällskap.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

CB och KGC är grundare och konsulter för Airmid Inc.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Complete Freund’s Adjuvant Reagent Fisher Scientific DF 311-360-5 Manufactured by Difco
Mycobacterium tuberculosis H37Ra Reagent Fisher Scientific DF3114-33-8 Manufactured by Difco
DA rat Animal Harlan Laboratories Females, 7-9 weeks old.
Glass syringes - 5 ml Tool Fisher Scientific 14-823-10 B
Metal bridge - 18G Tool Fisher Scientific 14-825-17L
Luer Lok plastic syringes - 3 ml Tool BD Biosciences 309585
Needles - 20G 1 1/2 Tool Fisher Scientific 14-826-5C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Induktion och klinisk Poängsättning av kronisk Skovvis Experimentell Autoimmun Encephalomyelitis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Induction and Clinical Scoring of Chronic-Relapsing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (5), e224, doi:10.3791/224 (2007).More

Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Induction and Clinical Scoring of Chronic-Relapsing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (5), e224, doi:10.3791/224 (2007).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter