Jonströmmen av BK-kanaler spelas in med den teknik patch clamp. BK kanaler uttrycks i<em> Xenopus oocyter</em> Genom att injicera budbärar-RNA. Den intracellulära lösning under inspelningarna patch clamp styrs av en perfusion system.
Protokollet som presenteras här är utformade för att studera aktivering av stora konduktans, spänning-och Ca 2 +-aktiverade K + (BK) kanaler. Protokollet kan också användas för att studera struktur och funktion relation till andra jonkanaler och receptorer signalsubstans 1. BK-kanaler är allmänt uttrycks i olika vävnader och har varit inblandade i många fysiologiska funktioner, inklusive reglering av glatt muskulatur kontraktion, frekvensinställning av inre hårceller och reglering av frisättningen av neurotransmittorer 2-6. BK-kanaler aktiveras av membran depolarisation och intracellulära Ca 2 + och Mg 2 + 6-9. Därför är det protokoll som utformats för att styra både membranet spänningen och den intracellulära lösningen. I detta protokoll, budbärar-RNA av BK-kanaler injiceras i Xenopus laevis oocyter (fas V-VI) följt av 2-5 dagars inkubation vid 18 ° C 10-13. Membran fläckar som innehåller ett eller flera BK kanaler exciderad med insidan ut konfigurering med hjälp av tekniker patch clamp 10-13. Den intracellulära sidan av plåstret är perfusion med önskade lösningar under inspelningen så att kanalen aktiveringen under olika förhållanden kan undersökas. Sammanfattningsvis är mRNA av BK-kanaler injiceras i Xenopus laevis oocyter att uttrycka kanal proteiner på äggcellen membranet, patch clamp teknik används för att spela in strömmar som flyter genom kanaler under kontrollerade spänning och intracellulära lösningar.
Äggcellen Uttrycket Systemet är idealiskt för elektrofysiologiska karakterisering av spänningsberoende jonkanaler De relativt låga bakgrund av endogent kanaler. Eftersom det är ett övergående uttryck system, ger det en effektiv metod för att utföra mutagenes studie av dessa kanaler. Det bör dock noteras att äggcellen uttrycket systemet är annorlunda än i däggdjursceller, så det kan finnas skillnader i post-translationell modifiering och samverkan med olika subenheter. Dessutom kan lipid koncentration ski…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag R01-HL70393 och R01-NS060706 till JCJC är professor i medicinsk teknik på Spencer T. Olin Endowment.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | ||
P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | ||
Perfusion System and Electronic Controller | AutoMate Scientific, Inc. | ValveLink 16 | Inner diameter of perfusion tip: 100 microns | |
Inverted Microscope | Olympus | CKX31 | ||
Glass Pipettes | VWR International | 53432-921 | ||
Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | ||
Amplifier | Axon Instruments | AXOPATCH 200B | ||
Computer Interface | INSTRUTECH Corporation | ITC-18 | ||
Headstage | Axon Instruments | CV 203BU |