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Biology

Grampo patch e Técnicas de Perfusão para estudar canais iônicos Expresso em Xenopus Oócitos

doi: 10.3791/2269 Published: January 10, 2011

Summary

Corrente iônica de canais BK é gravado usando técnicas de patch clamp. Canais BK são expressos em

Abstract

O protocolo aqui apresentado foi concebido para estudar a ativação da condutância grande tensão e Ca 2 +-K + ativados (BK) canais. O protocolo também pode ser usado para estudar a relação estrutura-função de canais iônicos e outros receptores de neurotransmissores 1. Canais BK são amplamente expressos em diferentes tecidos e têm sido implicados em muitas funções fisiológicas, incluindo a regulação da contração do músculo liso, Afinação da frequência de células ciliadas internas e regulação da liberação de neurotransmissores 2-6. BK canais são ativados por despolarização da membrana e por Ca 2 + intracelular e Mg 2 + 6-9. Portanto, o protocolo é projetado para controlar a tensão de membrana ea solução intracelular. Neste protocolo, o RNA mensageiro dos canais BK é injetado dentro de oócitos Xenopus laevis (estágio V-VI), seguido de 2-5 dias de incubação a 18 ° C 10-13. Remendos da membrana que contêm um ou vários canais BK são excisadas com a configuração de dentro para fora usando técnicas de patch-clamp 10-13. O lado intracelular do patch é perfundido com soluções desejadas durante a gravação de modo que a ativação de canais em diferentes condições podem ser examinados. Para resumir, o mRNA de canais BK é injetado dentro de oócitos Xenopus laevis para expressar proteínas canal na membrana do oócito; técnicas de patch clamp são usados ​​para gravar correntes que fluem através dos canais sob tensão controlada e soluções intracelular.

Protocol

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1. Injeção de mRNA em oócitos

  1. Injetar 0,05-50 ng de RNA mensageiro que foi transcrita in vitro em oócitos Xenopus laevis (estágio V-VI), utilizando Nanoject II Auto-nanolitros Injector (Drummond empresa Scientific, modelo 3-000-204). Repetir a injecção em uma dúzia de ovócitos para cada mRNA.
  2. Enxágüe os oócitos injetados duas vezes com solução ND-96 (96 mM de cloreto de sódio (NaCl, deputado 58,44 g / mol), 2 mM de cloreto de potássio (KCl, deputado 74,56 g / mol), 1,8 mM de cloreto de cálcio (CaCl 2 • 2H 2 O , o Sr. 147,02), 1 mM de cloreto de magnésio (MgCl 2 • 6H 2 O, o Sr. 203,31 g / mol), 5 mM 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES, deputado 238,31 g / mol), 2,5 mM piruvato de sódio (Mr 110,04 g / mol), pH e 1x penicilina-estreptomicina. 7.6), em seguida, colocá-los em uma placa de cultura e incubar a 18 ° C por 2 dias +.

2. Preparando o sistema de perfusão

Figura 1
Ilustração do sistema de perfusão Automatize ValveLink 16. O sistema de perfusão usa nitrogênio pressurizado para empurrar soluções para perfusão fora dos reservatórios de solução, através da perfusão tubulações, e para o lápis de perfusão e gorjeta. O fluxo de cada fluxo de solução de perfusão é controlada por uma válvula do reservatório e uma válvula eletrônica. Neste protocolo, um dos reservatórios não é pressurizado e funciona como um coletor de resíduos, bem como um mecanismo de liberação de pressão. (Imagem adaptada de http://www.autom8.com fornecedor website)

  1. Conectar as tubulações para o lápis de perfusão. Ligue o controlador de válvula eletrônica e abrir as válvulas eletrônicas.
  2. Para assegurar que as tubulações e os lápis de perfusão são livres de bolhas de entupir e ar, empurrar a água (DI) deionizada através de cada tubo usando uma seringa com água deionizada.
  3. Conecte o tubulações aos reservatórios solução e abrir a válvula do cilindro de gás nitrogênio pressurizado para aplicar.
  4. Abrir a válvula do reservatório para encher o tubo com a solução do reservatório. Flick da válvula do reservatório para remover as bolhas na solução, se necessário. Feche a válvula após o tubo é preenchido com a solução.
  5. Preencha a ponta de perfusão com água e aperte-o para o lápis de perfusão. Tenha cuidado para não prender as bolhas ao se conectar a ponta.
  6. Fixar o lápis de perfusão para o palco banho usando massa de modelar. Certifique-se que a ponta de perfusão é no espaço do banho. O sistema de perfusão está agora configurado.
  7. Adicione a água DI no banho. Certifique-se que a ponta de perfusão está submerso na água.
  8. Teste que cada solução de perfusão sai da ponta de perfusão corretamente. Fechar a válvula eletrônico conectado à tubulação do coletor de resíduos e abrir a válvula para uma solução de perfusão de cada vez (140 mM de hidróxido de potássio (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mM 4 - (2-hidroxietil) -1 - piperazineethanesulfonic ácido (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM de cloreto de potássio (KCl, M r 74,56 g / mol), 1 mM de etileno glicol bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'- tetraacetic ácido (EGTA, M r 380,35 g / mol), pH é ajustado para 7,1-7,2 por metanosulfonico ácido (meso 3, M r 96,1 g / mol), Ca 2 + ou Mg2 + é adicionado à concentração desejada quando necessário). Sob o microscópio, observe o jato de líquido de perfusão que sai da ponta de perfusão. Fechar a válvula para solução de perfusão e abrir a válvula para o coletor de resíduos. O jato de perfusão deve quase desaparecer. Repita o mesmo teste para todas as soluções para perfusão.
  9. Quando você tiver verificado que todas as soluções de fluxo de perfusão corretamente, substituir a água DI no banho com uma solução de banho (140 mM de hidróxido de potássio (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mM 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM de cloreto de potássio (KCl, M r 74,56 g / mol), pH é ajustado para 7,1-7,2 por metanosulfonico ácido (meso 3, M r 96,1 g / mol)).

3. Patch clamping

  1. Recobrimento do eletrodo de registro Ag com AgCl antes de cada patch clamping sessão. Primeiro, remova o fio de eletrodo do porta-pipeta e submergir o meia ponta do arame-eletrodo em um frasco contendo lixívia fresca pelo menos durante 15 minutos. Este depósitos uma camada de AgCl sobre o fio.
  2. Lavar o arame eletrodo com água deionizada e secar. Em seguida, instalar o eletrodo Ag / AgCl de volta no suporte da pipeta.
  3. Conecte o banho de eletrodo (referência) para o headstage e colocá-lo no banho. Isso prepara os eletrodos para gravação.
  4. Agora preparar para aquisição de dados. Ligue o computador e ligue a chave de hardware na porta da impressora de seu computador. A chave de hardware deve ser ligada para que você use o software de aquisição de dados, que é Heka pulso.
  5. Ligue o amplificador (Axon Instruments, AXOPATCH 200B) e começar a Heka Pulse. Carregar o arquivo de protocolo e ajustar as definições de configuração, tais como a Escala de estímulo. A meta para ajustar as definições de configuração é garantir que o potencial de teste é exatamente igual ao potencial de comando. Isso prepara o equipamento de aquisição de dados.
  6. Prepare oócitos. Oócito submergir o stripping em solução (200 mM N-Metil-D-glucamina (NMG, M r 195,22 g / mol), 200 mM Aspartato (sem K +) (M r 133,1 g / mol), 2 mM de cloreto de potássio (KCl , M r 74,56 g / mol), 10 mM de etileno glicol bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'-tetraacetic ácido (EGTA, M r 380,35 g / mol), 1 mM de cloreto de magnésio (MgCl 2 • 6H 2 O, M r 203,31 g / mol), 10 mM 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES, M r 238,31 g / mol), pH é ajustado para 7,4 por hidróxido de sódio (NaOH, M r 40,0 g / mol) por 5 -. 10 min A solução stripping destaca a membrana vitelina da membrana plasmática que torna possível para tirar a membrana vitelina.
  7. Gentilmente tira a membrana vitelina do oócito usando dois pares de fórceps. Um ovócito devitellinized é extremamente frágil e, portanto, deve ser movido o mínimo necessário.
  8. Tendo o cuidado de evitar expor o ovócito devitellinized ao ar ou bolhas, use uma pipeta de vidro preenchidos com solução suficiente para transferir o ovócito ao banho. Isso prepara o óvulo para a gravação.
  9. Prepare pipetas patch. Puxe a pipetas de vidro após a inserção de um tubo de vidro capilar (VWR International, Cat # 53432-921) em um Sutter P-97 Flaming / Brown Micropipeta Puller. Observe as pipetas ao microscópio para determinar a forma da ponta e diâmetro de abertura. O diâmetro de abertura deve ser 2-4 micrômetros.
  10. Para reduzir a corrente capacitiva durante a gravação e para garantir uma ponta lisa, o revestimento da ponta com cera e depois do fogo-polonês-lo.
  11. Encha a ponta da pipeta, colocando a ponta da pipeta dentro da solução de pipeta (140 mM de hidróxido de potássio (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mM 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM de cloreto de potássio (KCl, M r 74,56 g / mol), 2 mM de cloreto de magnésio (MgCl 2 • 6H 2 O, M r 203,31 g / mol), pH é ajustado para 7,1-7,2 por metanosulfonico ácido (meso 3, M r 96,1 g / mol)) e desenho o êmbolo. Este molha a ponta.
  12. Preencha pipeta 03/01 completa com pipeta solução utilizando uma seringa e coloque a pipeta no suporte da pipeta com a parte interna do eletrodo Ag / AgCl e entrar em contato com a solução da pipeta. Isto prepara a pipeta patch.
  13. Para extirpar um patch de dentro para fora do oócito preparado, encontrar a clara vantagem do ovócito sob o microscópio. Mover a pipeta de patch perto do oócito usando manipulador. Anote a resistência série do pipeta. A resistência série ideal da pipeta patch é entre 1-1,5 mohms quando preenchido com solução de pipeta e submerso em solução de banho.
  14. Empurre lentamente a pipeta contra o ovócito até a resistência aproximadamente dobra.
  15. Aplicar sucção suave para a membrana por via oral, através de um tubo de sucção que é conectado ao titular da pipeta até um selo giga-ohm é obtido. Estabilizar o patch, segurando-o em tensão -30 mV para um par de minutos.
  16. Para obter uma mancha de dentro para fora sobre o consumo, o patch rapidamente por empurrar a pipeta mais para o ovócito e, em seguida, puxando-o para fora.
  17. O patch de dentro para fora agora está pronto para fixação. Mover a pipeta holding o patch de dentro para fora para cerca de 100 mícrons de distância da abertura da ponta de perfusão.
  18. Fechar a válvula eletrônica para a recolha de resíduos e abrir a válvula do reservatório para a solução de perfusão desejado
  19. Começar a gravar correntes em todo o patch. Mudar a tensão e soluções de perfusão, como desejado.
  20. Quando você terminar a gravação, limpa a perfusão tubulações lápis, e empurrando a ponta através da água deionizada para evitar obstruções.

4. Resultados representante

Durante a preparação dos ovócitos para patch clamp, o tratamento 10/05 min de solução stripping seria separar a membrana vitelina da membrana plasmática, o que torna possível stripping a membrana vitelina.

A resistência série ideal da pipeta patch é entre 1-1,5 mohms quando preenchido com solução de pipeta e submerso em solução de banho.

Segue-se uma gravação representante de canais do tipo selvagem BK em um remendo de membrana de ovócitos. No canto superior esquerdo, as ondas quadradas indicam a tensão aplicada ao patch - a segunda etapa do aumentos de tensão de 50 mV a 200 mV com incremento de 50 mV. Abaixo está os traços correspondentes atuais, quando a solução de perfusão foi nominal 0 Ca 2 + (livre [Ca 2 +] é cerca de 0,5 nM). O emaumento da amplitude da corrente indica que a probabilidade de abrir canais BK aumenta com a tensão. No lado direito, o patch mesmo é perfundido com 1,0 mM Ca 2 +, quando aplicado com o protocolo mesma tensão. A amplitude da corrente aumenta mais sob a mesma tensão, indicando que a probabilidade aumenta com open [Ca 2 +].
Figura 2

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Discussion

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O sistema de expressão de ovócitos é ideal para a caracterização eletrofisiológica de canais voltagem-dependentes de íons devido ao fundo relativamente baixo de canais endógena. Além disso, uma vez que é um sistema de expressão transitória, ela fornece um método eficiente de realizar estudo de mutagênese destes canais. No entanto, deve-se notar que o sistema de expressão de ovócitos é diferente do que em células de mamíferos, assim, pode haver diferenças na modificação pós-traducional e associação com subunidades diferentes. Além disso, a concentração de lipídios pode variar entre as duas células que podem afetar as propriedades funcionais do canal.

Os tubos de perfusão, lápis e ponta deve ser limpo com água DI a cada vez após o experimento para evitar entupir. Sempre usar lixívia fresca para tratar o fio do eletrodo Ag ter certeza de que é revestido com AgCl, caso contrário a gravação será impreciso. Ajustar as definições de configuração para aquisição de dados para que o potencial de teste é exatamente igual ao potencial de comando. Seria útil para manter as pipetas correção limpa para usar uma tampa para protegê-los da terra e do fogo-polonês-los somente antes do uso.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health bolsas R01-R01-HL70393 e NS060706 para JCJC é um professor de engenharia biomédica na T. Spencer Olin Endowment.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector Drummond Scientific 3-000-204
P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
Perfusion System and Electronic Controller AutoMate Scientific, Inc. ValveLink 16 Inner diameter of perfusion tip: 100 microns
Inverted Microscope Olympus Corporation CKX31
Glass Pipettes VWR international 53432-921
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
Amplifier Axon Instruments AXOPATCH 200B
Computer Interface INSTRUTECH Corporation ITC-18
Headstage Axon Instruments CV 203BU

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References

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Cite this Article

Yang, J., Delaloye, K., Lee, U. S., Cui, J. Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. (47), e2269, doi:10.3791/2269 (2011).More

Yang, J., Delaloye, K., Lee, U. S., Cui, J. Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. (47), e2269, doi:10.3791/2269 (2011).

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