Summary
Wir zeigen, wie eine Verhaltens-Pharmakologie-Methode in einem appetitive olfaktorischen Konditionierung bei Honigbienen (Apis mellifera) durch systemische Applikation von Medikamenten zu implementieren. Diese Methode erlaubt Erforschung der Mechanismen, die Lernen und Gedächtnisbildung in eine einfache und zuverlässige Weise.
Abstract
Honigbienen (Apis mellifera) sind bekannt für ihre Kommunikations-und Orientierungsvermögen und für ihre beeindruckende Lernfähigkeit 1,2 bekannt. Weil das Überleben eines Bienenvolkes hängt von der Nutzung von Nahrungsquellen, lernen Sammlerinnen und auswendig variable Blume Websites sowie deren Rentabilität. Sammlerinnen können leicht in natürlicher Umgebung geschult werden, wo sie Futter an eine Futterstelle und lernen Sie die entsprechenden Signale wie Geruch oder Farbe. Appetitive assoziativen Lernens können auch unter kontrollierten Bedingungen im Labor durch Konditionierung des Rüssel-Erweiterung Reaktion (PER) von individuell nutzbar Honigbienen 3,4 untersucht werden. Das Paradigma des Lernens ermöglicht die Untersuchung der neuronalen und molekularen Mechanismen, die Lernen und Gedächtnisbildung in einer einfachen und zuverlässigen Weg 5-12 zugrunde liegen. Eine Verhaltenstherapie Pharmakologie Ansatz wird verwendet, um molekulare Mechanismen zu studieren. Drogen sind systemisch, mit der Funktion bestimmter Moleküle während oder nach dem Lernen und der Gedächtnisbildung 13-16 stören injiziert.
Hier zeigen wir, wie es zu nutzen Honigbienen in PER Klimaanlage Zug und wie Medikamente systemisch durch Injektion gelten in der Biene Flugmuskel.
Protocol
1. Catching Bees aus dem Hive
- Einen Tag vor dem Experiment beginnt, zwischen 2 und 4 Uhr, sind die Bienen verlassen den Stock gefangen. Dazu ein UV-Licht durchlässigen Plexiglas-Pyramide (Höhe = 30 cm, Spitze 3,5 x 3, 5 cm, Grundfläche 18 x 18 cm), die verschließbare an der Spitze und die Basis ist, wird bei einer 20 gehalten - 30 cm Abstand vor dem Flugloch mit der Basis offener und die Spitze geschlossen, so dass die Bienen verlassen den Stock der Basis der Pyramide geben. Die Basis wird dann geschlossen und die gefangenen Bienen ins Labor zur weiteren Behandlung gebracht.
2. Übertragen Bees aus der Pyramide in Glasflaschen
- Im Labor wird die Pyramide auf dem Sockel platziert. Die Wände der Pyramide sind abgedunkelt (z. B. mit einem Handtuch), aber die Spitze ist nicht abgedeckt. Aufgrund ihrer positiven Phototaxis werden Bienen die Pyramide durch den Scheitelpunkt zu verlassen, wenn sie geöffnet. Einer nach dem anderen, sind die Bienen von der Pyramide in Glasflaschen, indem Sie die Ampullen über die offene Spitze übertragen. Ein Fläschchen pro Biene verwendet. Deshalb steht an der Spitze geschlossen, wenn eine Biene die Flasche gelangt.
3. Harnessing Bees in Tubes
- Bienen sind durch Abkühlung in den Glasflaschen auf Eis 2,5-3,5 min immobilisiert. Es ist ratsam, die Biene zu sehen und entfernen Sie sie aus dem Eis, sobald er aufhört sich zu bewegen.
- Ein einziger immobilisiert Biene ist in einem kleinen Plastikschlauch mit Klebeband, so dass es in der Lage, seinen Rüssel frei, aber nicht den Kopf, Thorax oder Beine zu bewegen ist angespannt. Es ist wichtig, dass der Hals nicht komprimiert wird.
- Jede Biene in einem Kunststoffrohr fixiert wird in einer nummerierten Bohrloch auf einem Gestell für besseres Handling und Identifikation setzen. Nachdem es für die Konditionierung oder das Abrufen von Erinnerungen wurden entfernt die Röhre ist immer die exakt gleiche Bohrloch zurück.
4. Fütterung von Bienen
- Am ersten Abend (4-6 Uhr), nach dem Fang, sind die Bienen bis zur Sättigung mit Saccharose-Lösung (0,88 M, weißen, raffinierten Haushaltszucker in Leitungswasser gelöst) zugeführt. Um Feeds eine Biene, ist die PER durch Berühren ihrer Antennen mit Saccharose-Lösung und das Tier darf einen Tropfen (4 ul) von Saccharose-Lösung verbrauchen ausgelöst. Die Bienen sind eine nach der anderen, bis sie zeigen nicht mehr eine schnelle und zuverlässige PER, wenn die Antennen mit Saccharose-Lösung berührt zugeführt.
- Bei jeder nachfolgenden Abend (4-6 Uhr) des Experiments Bienen nacheinander viermal mit 1 Tropfen der Saccharose-Lösung (4 ul, 0,88 M, weißen, raffinierten Zucker in Leitungswasser gelöst) zugeführt. Es ist wichtig, dass Saccharose-Lösung nicht auf der Biene Antennen oder den Rüssel während der Fütterung und die Rohre sind nicht mit Saccharose-Lösung verunreinigt verschmiert. Bienen sollten nicht an oder nahe der Anlage vor Ort zugeführt werden, um die Möglichkeit der Zuordnung der Ausbildung Zusammenhang mit der Saccharose Reiz auszuschließen.
5. Keeping Harnessed Bees Übernachtung
- Bienen sind über Nacht in eine Plastikschüssel bei Raumtemperatur aufbewahrt. Leitungswasser ist in die Schüssel (ca. 0,5-1 cm hoch) gefüllt. Racks mit genutzt Bienen sind in der Schale über der Wasserlinie mit ELISA-Platten als Plattform platziert. Schließlich ist die Schüssel mit Pappe abgedeckt.
6. Olfaktorischen Konditionierung
Am ersten Morgen (10 Uhr) des Experiments olfaktorischen Konditionierung durchgeführt wird. Die konditionierten Reiz (CS) ist ein Geruch, ist der unbedingte Reiz (US) Saccharose-Lösung.
- 4 ul der Geruch (zB Nelkenöl) werden auf ein rundes Filterpapier (1,3 cm Durchmesser), die dann in eine 20 ml Spritze eingefügt pipettiert. Der Geruch ist unter einer Haube pipettiert und Filterspitzen werden verwendet, um eine Kontamination der Pipette zu verhindern.
- Das Rack mit genutzt Bienen in der Nähe der Klimaanlage vor Ort 30 min gestellt, bevor die Konditionierung Verfahren beginnt, sondern in einem Abstand zu der Stelle vor einem Abgasrohr, wo einzelne Bienen sind klimatisiert.
- Conditioning besteht aus drei Paarungen der Geruch (der bedingten Reiz, CS) und Saccharose-Lösung (dem unbedingten Reiz, den USA, 1,25 M) mit einem inter-trial-Intervall (ITI) von 10 min. Ein akustisches Signal geliefert für den Experimentator über einen Audio-Player sorgt für den genauen Zeitpunkt der Beginn des Stimulus, Reiz-Offset, Reizdauer und Platzierung. Eine Übernahme Studie beginnt mit einer 10 sec Platzierung des Tieres vor einem Auspuff. Kurz vor Ende der 10 Sekunden die Spritze mit dem Geruch ist 3 cm vor der Biene bei der Biene Antennen gezielt platziert. Anschließend wird der Geruch für 5 sec dargestellt, indem 20 mL Luft durch die Spritze. Nach den ersten 3 Sekunden der distalen Geißeln der beiden Antennen sind mit einer Saccharose-Lösung angefeuchtet Zahnstocher und Tiere dürfen die moistend Zahnstocher 4 Sek. lang lecken berührt. 13 Sek. nach dem CS Stimulation endet, Bienen aus dem Training Kontext genommen und zurück in das Rack ein. Insgesamt ein Training Studie dauert 28 Sek..
Es ist wichtig, dass weder die Biene Antennen noch der Rüssel mit Saccharose nach der Konditionierung abgedeckt sind. Deshalb muss sichergestellt werden, dass die Zahnstocher nur angefeuchtet mit Saccharose-Lösung und dass kein Tropfen Saccharoselösung Formular Zahnstocher werden. - Nach der Konditionierung der Racks sind zurück in die Schüssel gelegt.
- Das Verhalten der Tiere während des Versuchs, dh das Auftreten der PER während der Platzierung und CS und US-Darstellung, wird überwacht und nach unten durch den Versuchsleiter notiert.
7. Speicher Retention
- Retention-Tests können in beliebigen Intervallen (min bis Tage) durchgeführt werden. Das Rack mit den Bienen in der Nähe der Klimaanlage vor Ort 30 min gestellt, bevor der Speicher-Test beginnt.
- Ein Speicher-Test besteht aus 5 sec CS-Präsentation ohne US-Präsentation. Der Test beginnt mit einem 10 sec Platzierung des Tieres vor dem Auspuff. Anschließend wird der Geruch für 5 sec präsentiert, wie oben beschrieben. Das Verhalten des Tieres, also das Auftreten der PER während der Platzierung und der CS-Präsentation wird während des Experiments zur Kenntnis genommen.
- Am Ende des Experiments den Rüssel extention Antwort ist wieder ausgelöst durch Berührung der Antennen mit Saccharose-Lösung, um sicherzustellen, dass das Tier noch in der Lage, seinen Rüssel zu verlängern.
8. Systemische Injection
Der Zeitpunkt der systemischen Injektion hängt von der experimentellen Design.
- Ein kleines Loch ist in der Kutikula der hintere Teil der scutum neben dem scutal Riss über dem Flugmuskel 17 unter Verwendung einer Einweg-Injektionsnadel (21 G) hergestellt.
- Mit einer Glaskapillare wird 1 ul-Lösung durch das Loch in die Cuticula in die Flucht Muskel injiziert. Geschulte Experimentatoren in der Lage, eine Biene zu injizieren alle 30 sec, so dass ein genauer Zeitplan für Einspritz-und Klimaanlagen.
9. Fütterung von Bienen während des Experiments
- Am Abend (4-6 Uhr) nach der Konditionierung, sind Bienen nacheinander viermal mit 1 Tropfen der Saccharose-Lösung (4 ul, 0,88 M, weißen, raffinierten Zucker in Leitungswasser gelöst) zugeführt. Es ist wichtig, dass Saccharose-Lösung nicht auf der Biene Antennen oder den Rüssel während der Fütterung und die Rohre sind nicht mit Saccharose-Lösung verunreinigt verschmiert. Bienen sollten nicht an oder nahe der Anlage vor Ort zugeführt werden, um die Möglichkeit der Zuordnung der Ausbildung Zusammenhang mit der Saccharose Reiz auszuschließen.
10. Datenerhebung und Datenanalyse
- Vorkommen des Rüssels Erweiterung Reaktion während des Experiments wird überwacht. Eine Biene ist erzielt, positiv, wenn es seinen Rüssel erstreckt sich zwischen dem Beginn der CS und der Präsentation in den USA (im Training) oder während der CS-Präsentation (während der Testphase), Überqueren einer gedachten Linie zwischen den offenen Mandibeln.
- Um in der Analyse Tiere aufgenommen werden muss zwei Kriterien erfüllen: sie müssen die ganze Experiment zu überleben, und sie müssen das Unbedingte Rüssel Erweiterung Reaktion (PER) zu Saccharose-Lösung zeigen, am Ende des Experiments. Der Prozentsatz der Bienen, welche die PER bei der Akquisition und Kundenbindung Tests ist für jeden CS-Präsentation dargestellt.
11. Repräsentative Ergebnisse:
Zwei Experimente werden hier vorgestellt.
Im ersten Experiment betrachten wir die Auswirkungen der systemischen Injektion von Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS; in mM: 137 NaCl, 2,7 KCl, 10,1 Na 2 HPO 4, 1,8 KH 2 PO 4, pH 7, 2) auf das Lernen und Langzeitgedächtnis Bildung. Drei Gruppen von Bienen wurden mit drei CS-US-Paarungen mit einem inter-trial Intervall von 10 min trainiert: ein nicht-behandelten Gruppe, eine Gruppe, die mit 1 ul PBS vor dem Training 30 min injiziert wurde, und ein Schein-injizierten Gruppe behandelt die genauso wie die PBS-injizierten Gruppe, aber ohne Injektion PBS. 24 h nach dem Training Speicher wurde mit einem CS-Präsentation in allen drei Gruppen getestet. Der Prozentsatz der Tiere mit der konditionierte Reaktion während der Konditionierung deutlich erhöht in den drei Trainings-Studien (Abb.1, ANOVA für wiederholte Messungen für den Faktor Zeit F 2378 = 340.456, p <0,05). Kein Unterschied in PER konnte zwischen den drei Gruppen während der Konditionierung beobachtet werden (ANOVA für wiederholte Messungen für den Faktor Gruppen F2, 189 = 1299, p> 0,05). Dies gilt für einen 24-h Retention-Test (F2, 187 = 0752, p> 0,05) gilt beim Vergleich von nicht-behandelten Tieren mit PBS-Injektion und schein-injizierten Tieren.
Im zweiten Experiment demonstrieren wir die Hemmung der Merkfähigkeit drei und vier Tage nach dem Training, wenn die Protein-Synthese-Hemmer Anisomycin (10 mM) systemisch wurde 30 min nach drei CS-US-Paarungen injiziert. Vergleich eines Anisomycin-injizierten Gruppe mit einer PBS-injizierten Gruppe zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen während der Sperrfrist test (Abb.2, ANOVA für wiederholte Messungen für den Faktor Gruppe F1, 94 = 8,86, p <0,05). Ein wesentlicher Unterschied kann bei der Speicher-Test an Tag 3 und Tag 4 eingehalten werden. Dies ähnelt den Ergebnissen der Wüstenberg et al. 18, der auch Bienen mit drei CS-US-Paarungen gewährt, allerdings mit einem anderen Protokoll.
Abbildung 1. Cuticula Läsion oder Injektion von PBS, ändert nichts an Akquisitions-und Merkfähigkeit. Animals mit drei CS-US-Paarungen (Erwerb) ausgebildet wurden. Nach 24 h wurde Speicher getestet (Memory Retention). Dreißig Minuten vor dem Training, war ein Loch in die Cuticula aus zwei Gruppen (Läsion, PBS) und eine dieser Gruppen wurde mit 1 ul PBS (PBS) injiziert. Eine dritte Gruppe blieb erhalten (keine Behandlung). Präsentiert wird der Prozentsatz der Tiere jeder Gruppe reagiert auf Geruch Präsentation mit einem PRO. Eine ANOVA zeigt keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen in der Akquisitionsphase (F2, 189 = 1.299, p> 0,05) oder in dem Speicher (F2, 187 = 0,752, p> 0,05).
Abbildung 2. Die Injektion von Anisomycin 40 min nach dem letzten CS-US Paarung reduziert Merkfähigkeit drei Tage und 4 Tage nach dem Training. Die Tiere wurden mit drei CS-US-Paarungen (Erwerb) geschult und injiziert mit 1 ul 10 mM Anisomycin (Aniso) oder 1 ul PBS 1 h nach dem ersten Training Studie. Speicher getestet wurde (Memory Retention) 24 h, 48 h, 72 h und 96 h später. Präsentiert wird der Anteil der Tiere pro Gruppe reagiert auf Geruch Präsentation mit einem PRO. Die Injektion von Anisomycin führt zu einer signifikanten Reduktion der Merkfähigkeit 72 h und 96 h nach dem Training (F1, 94 = 8.86, p <0,05) als offenbarte durch eine ANOVA.
Discussion
- Catching Bienen: Um erfahrenen Sammlerinnen sammeln die Bienen entweder am Vormittag oder am Nachmittag gefangen, die Vermeidung der Zeit, in der jungen Bienen auf Orientierung Flüge 19 sind. Sammlerinnen entweder Pollen oder Nektar. Die Unterschiede zwischen Pollen und Nektar Sammlerinnen haben nach ihren Zucker reagieren und ihre Lernfähigkeit 20 beobachtet worden. Um nur Nektar Sammlerinnen zu fangen, eine künstliche Nahrung mit einer Saccharose-Lösung gefüllt werden kann in der Nähe des Bienenstocks und Tiere installiert werden können dort abgeholt werden. Pollensammlerinnen Rückkehr in den Bienenstock kann durch den Pollen Körben auf ihren Hinterbeinen 20 identifiziert werden.
- Befestigung und Handhabung: Erweiterte Kühlung der Bienen auf dem Eis vermieden werden sollten, weil sie ihre Fähigkeit zu lernen und zu überleben, bis zum Ende des Experiments beeinflussen könnten werden. Tarsi müssen sorgfältig innerhalb der Röhre befestigt werden, um versehentliche Stimulation mit Saccharose-Lösung zu vermeiden. Dies ist wichtig, weil die Bienen gezeigt wurde, dass durch die Fußwurzel Stimulation mit Rohrohrzucker Lösung 3,21 lernen.
- Olfaktorischen Konditionierung: Die Anzahl der Konditionierung Studien, die inter-Studie Intervall, und der Test Zeitpunkt variiert je nach Schwerpunkt der Studie 3,22 sein.
- Fütterung: Die Sättigung Ebene der Bienen ist bekannt, dass ihre Lernleistung und Merkfähigkeit 3,23 beeinflussen. Dies hat zu berücksichtigen bei der Planung der Experimente.
- Injection: Air Säcke sind in der Honigbiene Thorax 17 angeordnet. Diese wichtigen Teile der Atemwege sind notwendig für das Überleben. So ist darauf zu achten nicht auf die Luftsäcke während der Injektion zu beschädigen. Die Freisetzung von Luftblasen zeigt Schäden an der Luftsäcke.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Neuronale Grundlagen des Lernens (BFNL) DE Wir danken Randolf Menzel für wertvolle Kommentare zu einer früheren Fassung des Manuskripts: Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss aus dem deutschen Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) innerhalb des Bernstein Fokus unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syringe Omnifix 20 ml | B. Braun Medical | 4616200 V | |
| White refined household sugar | Kaisers Supermarket, Berlin, Germany | ||
| Clove oil | Bombastus, Freital, Germany | ||
| Multipette plus | Eppendorf | 4981 000.019 | |
| Rack for 30 bee tubes | Home made | ||
| Plastic tubes | Home made | ||
| UV light-permeable plexiglass pyramid | Home made | height = 30cm,apex 3.5 x 3.5cm,base 18x18cm | |
| Sticky tape | Tesa, Hamburg, Germany | ||
| Capillator sticks 1-5μl | Selzer | ||
| Capillator tips 1-5μl | Selzer | ||
| Filter paper 0.16-0.2 mm thick | Macherey-Nagel | MN 616 or MN615 | Adjusted to circular pieces with a 1.3 cm diameter |
| Disposable hypodermic needle | B. Braun Medical | 4657683 | 0.45 mm diameter |
References
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