Summary
Мы демонстрируем, как реализовать метод поведенческой фармакологии аппетит обонятельных парадигмы кондиционирования пчел (Apis Mellifera) путем системного применения лекарственных препаратов. Этот метод позволяет исследовать механизмы, лежащие обучения и формирования памяти в простой и надежный способ.
Abstract
Медоносные пчелы (Apis Mellifera) хорошо известны за их связи и навыки ориентации и для их впечатляющих 1,2 возможностью обучения. Потому выживание колонии медоносных пчел зависит от эксплуатации источников пищи, собирателей пчел учиться и запоминать переменная сайтов цветок, а также их рентабельность. Добытчик пчел может быть легко обучается в естественных условиях, где они кормов на кормление сайт и узнать соответствующие сигналы, такие как запах или цвет. Аппетит ассоциативного обучения также может быть изучен в контролируемых условиях в лаборатории кондиционирования ответ хоботок расширение (PER) индивидуально запряженных пчел 3,4. Это обучение парадигма позволяет изучение нейронных и молекулярных механизмов, лежащих в основе обучения и формирования памяти в простой и очень надежный способ 5-12. Поведенческий подход фармакологии используется для изучения молекулярных механизмов. Наркотики вводятся системно вмешиваться в функции специфических молекул во время или после обучения и формирования памяти 13-16.
Здесь мы показываем, как тренировать запряженных пчел в расчете на кондиционирование и как применять препараты системно путем инъекции в мышцу полета пчелы.
Protocol
1. Ловля пчел из улья
- За день до эксперимента начинается, от 2 до 4 часов вечера, оставив пчелы улей ловят. Чтобы сделать это, ультрафиолетовый свет пропускает плексигласа пирамиды (высота = 30 см, вершиной 3,5 х 3, 5 см, основание 18 х 18 см), замыкаем на вершины и основания, проводится в 20 - 30 см, расстояние перед входом улей с базой открытых и закрытых вершине так, чтобы пчелы улей оставляя ввести основание пирамиды. База закрывается и захватили пчелы принесли в лабораторию для дальнейшей обработки.
2. Передача пчел от пирамиды в стеклянные флаконы
- В лаборатории, пирамиды находится на его основе. Стены пирамиды затемненной (например, с полотенцем), но вершиной остается открытым. Из-за их положительный фототаксис, пчелы оставят пирамиды через вершину при открытии. Один за другим пчелам передаются от пирамиды в стеклянные флаконы, держа флаконы над открытым вершине. Один флакон используется в пчелу. Таким образом, вершина закрыта, когда одна пчела входит флакон.
3. Использование пчел в трубах
- Пчелы иммобилизованных путем охлаждения их в стеклянных флаконах на льду в течение 2,5-3,5 мин. Желательно, чтобы посмотреть пчелу и удалить его из льда, как только он перестает двигаться.
- Одного иммобилизованного пчела запряженной в небольшой пластиковой трубкой с липкой лентой, так, что он может двигаться хоботок свободно, но не его голову, грудь и ноги. Важно, чтобы шея не сжимается.
- Каждая пчела зафиксирован в пластиковая трубка вводится в номер скважины на стойке для лучшей управляемости и идентификации. После того, как был удален для поиска кондиционирования или памяти трубки всегда возвращается в ту же самую скважину.
4. Кормление пчел
- В первый же вечер (4-6 часов), после поимки, пчелы кормятся на насыщение с раствором сахарозы (0,88 М, белого рафинированного сахара бытовой растворенных в водопроводной воде). Чтобы кормить пчел, его PER это вызвало, коснувшись его антенны с раствором сахарозы и животных разрешено потреблять одной капли (4 мкл) раствора сахарозы. Пчелы кормят один за другим, пока они больше не показывать быстрый и надежный PER, когда их антенны коснулась раствором сахарозы.
- На каждый последующий вечер (4-6 часов) эксперимента пчелы кормят один за другим четыре раза с 1 капли раствора сахарозы (4 мкл, 0,88 М, белого рафинированного сахара решена в водопроводной воде). Важно, чтобы раствор сахарозы не намазывается на антеннах пчелы или хоботок во время кормления и что трубы не загрязненных раствором сахарозы. Пчелы не должен питаться в или около кондиционирования сайта, чтобы исключить возможность привлечения к подготовке контексте с сахарозой стимул.
5. Хранение Конфекционированные Пчелы Ночь
- Пчел держат в течение ночи в пластиковой миске при комнатной температуре. Водопроводная вода заливается в миску (примерно 0,5-1 см в высоту). Стойки с запряженной пчелы помещаются в чаше над ватерлинией использованием ИФА пластин в качестве платформы. Наконец, чаша покрыта картоном.
6. Обонятельные кондиционирования
В первое утро (10 часов) эксперимента обонятельных кондиционирования осуществляется. Условный раздражитель (ВС) запах, безусловного раздражителя (США) раствором сахарозы.
- 4 мкл запаха (например, гвоздичное масло) пипетируются на круглый бумажный фильтр (1,3 см в диаметре), который затем вставляется в 20 мл шприца. Запах пипеткой под капотом и фильтр советы используются для предотвращения загрязнения пипетки.
- Стойка с запряженной пчел находится рядом с кондиционирования сайт за 30 минут до процедуры кондиционирования запускается, но на расстояние до места в передней части выхлопной трубы, где одной пчелы обусловлены.
- Кондиционер состоит из трех пар запаха (условный раздражитель, CS) и раствором сахарозы (безусловного раздражителя, США, 1,25 М) в том следственном интервал (ITI) от 10 мин. Акустический сигнал доставляется экспериментатор через аудио-плеер обеспечивает точные сроки начала стимула, стимул смещение, длительности стимула и размещения. Приобретение суде начинается с 10 с размещением животных в передней части выхлопной трубы. Незадолго до конца 10 сек шприц, содержащий запах помещается 3 см от пчел, направленных на антеннах пчелы. Впоследствии запах представлен в течение 5 секунд, нажав 20 мл воздуха через шприц. После первых 3 сек дистальных жгутиков обеих антенн тронуты раствором сахарозы увлажненных зубочистку и животных разрешено лизать moistend зубочистку на 4 сек. 13 сек после стимуляции CS концов, пчелы изымаются из контекста и обучение вновь устанавливается в стойку. Всего один учебный судебный процесс длится 28 сек.
Важно, что ни пчел, ни антенн хоботок покрыты сахарозой после кондиционирования. Поэтому оно должно быть обеспечено, что только зубочистка, смоченной раствором сахарозы и что ни капли раствора сахарозы форму на зубочистку. - После кондиционирования стойки помещены обратно в миску.
- Поведение животных в ходе эксперимента, то есть возникновение PER во время размещения и CS и США презентации, контролируется и записал экспериментатором.
7. Запоминание
- Сохранение тесты могут быть выполнены в любом интервале (мин до нескольких дней). Стойка с пчелами, расположена рядом кондиционирования сайт за 30 минут до начала тестирования памяти.
- Тест памяти состоит из 5 сек CS презентации без предъявления США. Тест начинается с 10 сек размещения животных в передней части выхлопной трубы. Впоследствии запах представлен в течение 5 секунд, как описано выше. Поведение животных, т.е. появление PER во время размещения и презентации CS является записал во время эксперимента.
- В конце эксперимента ответ хоботок расширением снова вызвали прикосновением антенн с раствором сахарозы, чтобы животное все еще в состоянии расширить свой хоботок.
8. Системная инъекций
Момент времени системных инъекций зависит от эксперимента.
- Маленькое отверстие сделано в кутикулы из задней части щитка рядом с трещиной scutal выше 17 полета мышцы с помощью одноразовой иглой подкожно (21 G).
- Использование стеклянных капилляра, 1 мкл раствора вводится через отверстие в кутикулы в полете мышцы. Обученные экспериментаторы могут придать одной пчелиной каждые 30 сек, позволяя точное время впрыска и кондиционирования.
9. Кормление пчел во время эксперимента
- На вечер (4-6 часов) после кондиционирования, пчелы кормят один за другим четыре раза с 1 капли раствора сахарозы (4 мкл, 0,88 М, белого рафинированного сахара, растворенных в водопроводной воде). Важно, чтобы раствор сахарозы не намазывается на антеннах пчелы или хоботок во время кормления и что трубы не загрязненных раствором сахарозы. Пчелы не должен питаться в или около кондиционирования сайта, чтобы исключить возможность привлечения к подготовке контексте с сахарозой стимул.
10. Сбор и анализ данных
- Появление ответа расширение хоботок в ходе эксперимента находится под контролем. Пчела забил положительной, если она распространяется хоботок между началом CS, и приводимые в США (во время обучения) или во время презентации CS (во время тестовой фазы), пересекая виртуальная линия между открытыми челюстями.
- Для включения в анализ животных, должны отвечать двум критериям: они должны выжить всего эксперимента они должны проявлять безусловное расширение хоботок ответа (PER) в растворе сахарозы в конце эксперимента. Процент пчел показывает PER во время приобретения и удержания тестов строится для каждой презентации CS.
11. Представитель Результаты:
Два эксперимента представлены здесь.
В первом эксперименте мы посмотрим на влияние системного введения фосфатно-солевом буфере (PBS, в мм: 137 NaCl, 2,7 KCl, 10,1 Na 2 HPO 4, 1,8 KH 2 PO 4, рН 7, 2) по обучению и долгосрочного формирования памяти. Три группы пчел были обучены с тремя CS-американских пар с между судом интервалом в 10 мин: необработанные группы, группы, которые вводили 1 мкл PBS 30 минут до тренировки, и липа вводили группе, получавшей так же, как PBS впрыском группы, но без инъекционных PBS. 24 ч после тренировки памяти тестировался с одной системе координат презентации во всех трех группах. Процент животных показывает условный рефлекс во время кондиционирования значительно возрастает во всех трех испытаниях обучения (рис. 1, ANOVA для повторных измерений для временной фактор F 2378 = 340 456, р <0,05). Никакой разницы в процентах можно было наблюдать между тремя группами во время кондиционирования (ANOVA для повторных измерений для фактор-группы F2, 189 = 1299, р> 0,05). Это справедливо для 24 часов удержания тест (F2, 187 = 0752, р> 0,05) при сравнении необработанных животных с PBS впрыском и фиктивными впрыском животных.
Во втором эксперименте мы демонстрируем торможение сохранение данных в памяти трех-четырех дней после тренировки, когда синтез белка ингибитора anisomycin (10 мМ) системно вводят 30 мин после трех CS-американских пар. Сравнение anisomycin впрыском группы с PBS впрыском группа выявляет существенной разницы между группами во время удержания тEST (рис. 2, ANOVA для повторных измерений для фактор-группы F1, 94 = 8,86, р <0,05). Основное различие можно наблюдать на проверку памяти на 3 день и 4-й день. Это напоминает результаты Wüstenberg и соавт. 18 лет, которые также обусловлены пчел с тремя CS-американских пар, хотя и с другой протокол.
Рисунок 1. Поражение кутикулы или инъекции PBS не меняет приобретение и сохранение данных в памяти. Животные были обучены с тремя CS-американских пар (приобретение). Через 24 ч, память была протестирована (Запоминание). За тридцать минут до тренировки, отверстие было сделано в кутикулы из двух групп (поражения, PBS) и одной из этих групп вводили 1 мкл PBS (PBS). Третья группа осталась без изменений (без лечения). Представлен процент животных для каждой группы в ответ на запах презентацию с PER. Дисперсионного анализа не выявили каких-либо существенных различий между группами в стадии приобретения (F2, 189 = 1,299, р> 0,05) или сохранение данных в памяти (F2, 187 = 0,752, р> 0,05).
Рисунок 2. Инъекция anisomycin 40 минут после последнего CS-американских спаривания уменьшает сохранение данных в памяти три дня и четыре дня после тренировки. Животные были обучены с тремя CS-американских пар (приобретение) и вводят с 1 мкл 10 мМ anisomycin (Aniso) или 1 мкл PBS 1 ч после первого судебного процесса обучения. Память была проверена (Запоминание) 24 ч, 48 ч, 72 ч и 96 ч позже. Представлен процент животных в группе реагирования на запах презентацию с PER. Инъекция anisomycin приводит к значительному снижению сохранение данных в памяти 72 ч и 96 ч после тренировки (F1, 94 = 8,86, р <0,05), как показал ANOVA.
Discussion
- Ловля пчел: Для сбора опытных кормления пчел, пчел пойманы или утром или днем, избегая время, когда молодые пчелы от ориентации рейсы 19. Фуражиры собирают либо пыльцу или нектар. Различия между пыльцой и нектаром фуражиров были обнаружены в соответствии с их отзывчивость сахар и их способности к обучению 20. Для того, чтобы ловить только фуражиры нектар, искусственным источником пищи заполнены раствором сахарозы могут быть установлены возле ульев и животных могут быть собраны там. Пыльца фуражиров возвращения в улей, можно определить по пыльце корзины на задних ногах 20.
- Фиксация и обработка: Расширенный охлаждения пчел на льду следует избегать, поскольку она может повлиять на их способность к обучению и дожить до конца эксперимента. Лапки должны быть закреплены тщательно внутри трубки, чтобы избежать случайного стимуляции с раствором сахарозы. Это важно, потому что пчелы, как было показано учиться на предплюсны стимуляции succrose решение 3,21.
- Обонятельные кондиционирования: число кондиционирования испытаний, в том следственном интервала, а точку время тестирования может варьироваться в зависимости от направленности исследования 3,22.
- Питание: насыщение уровня пчелы, как известно, влияет на их обучение производительности и сохранение данных в памяти 3,23. Это должно быть принято во внимание при планировании экспериментов.
- Инъекция: воздушные мешки расположены в 17 грудной клетки медоносной пчелы. Эти жизненно важные части дыхательной системы, необходимые для выживания. Таким образом следует проявлять осторожность, чтобы не повредить воздушные мешки во время инъекции. Выпуска пузырьков воздуха указывает на повреждение воздушных мешков.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом немецкого Федерального министерства образования и научных исследований (BMBF) в рамках Фокус Бернштейна: Нейронные основы обучения (BFNL), чтобы DE Мы благодарим Рандольф Менцель за ценные замечания на более раннюю версию рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syringe Omnifix 20 ml | B. Braun Medical | 4616200 V | |
| White refined household sugar | Kaisers Supermarket, Berlin, Germany | ||
| Clove oil | Bombastus, Freital, Germany | ||
| Multipette plus | Eppendorf | 4981 000.019 | |
| Rack for 30 bee tubes | Home made | ||
| Plastic tubes | Home made | ||
| UV light-permeable plexiglass pyramid | Home made | height = 30cm,apex 3.5 x 3.5cm,base 18x18cm | |
| Sticky tape | Tesa, Hamburg, Germany | ||
| Capillator sticks 1-5μl | Selzer | ||
| Capillator tips 1-5μl | Selzer | ||
| Filter paper 0.16-0.2 mm thick | Macherey-Nagel | MN 616 or MN615 | Adjusted to circular pieces with a 1.3 cm diameter |
| Disposable hypodermic needle | B. Braun Medical | 4657683 | 0.45 mm diameter |
References
- Menzel, R., Giurfa, M. Cognitive architecture of a mini-brain: the honeybee. Trends Cogn Sci. 5, 62-71 (2001).
- Menzel, R., Leboulle, G., Eisenhardt, D. Small brains, bright minds. Cell. 124, 237-239 (2006).
- Menzel, R. Neurobiology of comparative cognition. Kesner, R. P., Olton, D. S. , Lawrence Erlbaum Associates Publishers. Hillsday, New Jersey, Hove, London. (1990).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. Classical-Conditioning of Proboscis Extension in Honeybees (Apis-Mellifera). J. Comp. Psyc. 97, 107-119 (1983).
- Menzel, R., Muller, U. Learning and memory in honeybees: from behavior to neural substrates. Annu. Rev. Neurosci. 19, 379-404 (1996).
- Menzel, R. Memory dynamics in the honeybee. Journal of Comparative Physiology A-Neuroethology Sensory Neural and Behavioral Physiology. 185, 323-340 (1999).
- Menzel, R. Searching for the memory trace in a mini-brain, the honeybee. Learn. Mem. 8, 53-62 (2001).
- Eisenhardt, D. Learning and memory formation in the honeybee (Apis mellifera) and its dependency on the cAMP-protein kinase A pathway. Animal Biology. 56, 259-278 (2006).
- Hourcade, B., Muenz, T. S., Sandoz, J. C., Rossler, W., Devaud, J. M. Long-term memory leads to synaptic reorganization in the mushroom bodies: a memory trace in the insect brain. J. Neurosci. 30, 6461-6465 (2010).
- Denker, M., Finke, R., Schaupp, F., Grun, S., Menzel, R. Neural correlates of odor learning in the honeybee antennal lobe. Eur. J. Neurosci. 31, 119-133 (2010).
- Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. Associative and non-associative plasticity in kenyon cells of the honeybee mushroom body. Front Syst. Neurosci. 2, 3-3 (2008).
- Okada, R., Rybak, J., Manz, G., Menzel, R. Learning-related plasticity in PE1 and other mushroom body-extrinsic neurons in the honeybee brain. J. Neurosci. 27, 11736-11747 (2007).
- Muller, U. Prolonged activation of cAMP-dependent protein kinase during conditioning induces long-term memory in honeybees. Neuron. 27, 159-168 (2000).
- Locatelli, F., Bundrock, G., Muller, U. Focal and temporal release of glutamate in the mushroom bodies improves olfactory memory in Apis mellifera. J. Neurosci. 25, 11614-11618 (2005).
- Stollhoff, N., Menzel, R., Eisenhardt, D. Spontaneous recovery from extinction depends on the reconsolidation of the acquisition memory in an appetitive learning paradigm in the honeybee (Apis mellifera. J. Neurosci. 25, 4485-4492 (2005).
- Stollhoff, N., Eisenhardt, D. Consolidation of an extinction memory depends on the unconditioned stimulus magnitude previously experienced during training. J. Neurosci. 29, 9644-9650 (2009).
- Snodgrass, R. E. Anatomy of the honeybee. , Comstock Publishing Associates. New York. (1956).
- Wustenberg, D., Gerber, B., Menzel, R. Short communication: long- but not medium-term retention of olfactory memories in honeybees is impaired by actinomycin D and anisomycin. Eur. J. Neurosci. 10, 2742-2745 (1998).
- Vollbehr, J. Zur Orientierung junger Honigbienen bei ihrem 1. Orientierungsflug. Zool. Jb. Physiol. 79, 33-69 (1975).
- Scheiner, R., Erber, J., Page, R. E. Tactile learning and the individual evaluation of the reward in honey bees (Apis mellifera L.). J. Comp Physiol [A]. 185, 1-10 (1999).
- Sanchez, B. rito, G, M. Behavioral studies on tarsal gustation in honeybees: sucrose responsiveness and sucrose-mediated olfactory conditioning. J. Comp Physiol A Neuroethol. Sens. Neural Behav. Physiol. 194, 861-869 (2008).
- Menzel, R., Manz, G., Menzel, R., Greggers, U. Massed and spaced learning in honeybees: the role of CS, US, the intertrial interval, and the test interval. Learn. Mem. , 198-208 (2001).
- Friedrich, A., Thomas, U., Muller, U. Learning at different satiation levels reveals parallel functions for the cAMP-protein kinase A cascade in formation of long-term memory. J. Neurosci. 24, 4460-4468 (2004).
