Summary
우리는 마약 조직의 응용 프로그램에서 꿀벌의 후각 appetitive 에어컨 패러다임 (아피스 mellifera)의 행동 약리학 방법을 구현하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 메커니즘 기본 학습과 간단하고 안정적인 방식으로 메모리 형성의 조사를 허용합니다.
Abstract
꿀벌 (아피스 mellifera)은 잘 그들의 의사 소통 및 오리 엔테이션 기술에 대한 그들의 인상적인 학습 능력 1,2 알려져 있습니다. 꿀벌 콜로니의 생존 식량 자원의 착취에 의존하기 때문에, 마초 징발 대원의 꿀벌 배우고 변수 꽃 사이트뿐만 아니라 수익성을 외워 두세요. 마초 징발 대원의 꿀벌은 쉽게 자연 설정에서 훈련을 될 수있는 그들이 먹이 사이트에서 마초와 같은 냄새 또는 색상으로 관련 신호를 배웁니다. Appetitive 연관 학습도 컨디셔닝 개별적으로 무력화 꿀벌 3,4의 코 확장 응답 (당)에 의해 실험실에서 제어 조건에서 공부하실 수 있습니다. 이 학습 패러다임은 간단하고 신뢰성이 높은 방법으로 5-12에서 학습과 기억 형성을 기초의 연결 및 분자 메커니즘 연구를 수 있습니다. 행동 약리학 접근은 분자 메커니즘을 연구하는 데 사용됩니다. 마약은 학습과 기억 형성 13-16 동안이나 이후에 특정 분자의 기능을 방해 systemically 주입하고 있습니다.
여기 PER 시설의 무력화 꿀벌을 훈련하는 방법과 비 비행 근육에 주사로 약물 systemically을 적용하는 방법을 보여줍니다.
Protocol
1. 하이브에서 밀린 꿀벌
- 실험 2 4시 사이, 시작 하루 전에 하이브를 떠나 꿀벌 체포됩니다. 이렇게하려면, UV 빛을 투과 플렉시 글라스 피라미드 (높이 = 30cm, 아펙스 3,5가 X 3, 5cm,베이스 18 X 18cm) 꼭대기와 바닥에서 closable는, 20에서 열립니다 - 기본 열고 꼭대기로 벌집 입구 앞 30cm의 거리는 벌집을 떠나는 꿀벌은 피라미드의 기초를 입력되도록 마감했다. 기본은 다음 닫히고 캡처한 꿀벌은 추가 처리를 위해 실험실로 이동됩니다.
2. 유리 튜브 속으로 피라미드에서 꿀벌을 전송
- 연구실에서 피라미드가 그 기지에 배치됩니다. 피라미드의 벽은 어두운 아르 (수건 등)하지만, 꼭대기가 밝혀낸 남아 있습니다. 열었을 때 때문에 그들의 긍정적인 phototaxis의 꿀벌은 꼭대기를 통해 피라미드를 벗어나게됩니다. 하나 하나는, 꿀벌은 열 꼭대기 위에 튜브를 개최하여 유리 튜브로 피라미드에서 전송됩니다. 한 병에은 꿀벌마다 사용됩니다. 따라서, 꼭대기 한 벌이 그 병을를 입력하면 닫힙니다.
3. 튜브의 Harnessing 비즈
- 꿀벌은 2.5-3.5 분 얼음 유리 튜브에 냉각에 의해 움직일 수 있습니다. 비보고 즉시 움직 정류장으로 얼음을 제거하는 것이 좋습니다입니다.
- 단일 고정 꿀벌은 그것이 자유롭게 아니지만 머리, 흉부 또는 다리의 코를 이동할 수 있습니다 이러한 끈적끈적한 테이프로 작은 플라스틱 튜브에 무력화됩니다. 목이 압축되지 않습니다 것이 중요합니다.
- 플라스틱 튜브에서 수정된 모든 꿀벌들은 더 나은 핸들링과 식별을위한 선반에 정리 시추공 안으로 들어가게된다. 그것이 컨디셔닝 또는 메모리 검색을 위해 제거된 후 튜브는 항상 동일한 시추공에 반환됩니다.
4. 수유 비즈
- 첫 번째 저녁 (4-6시)에, 잡은 후, 꿀벌은 자당 솔루션 (0,88 M, 수돗물에 녹아있는 흰색 정제 가정용 설탕)과 포만에 공급하고 있습니다. 꿀벌 먹이를 위해서는 PER은 자당 솔루션의 안테나를 감동 동물 자당 솔루션 중 하나 소적 (4 μL)를 소비 허용 의해 elicited 수 있습니다. 자신의 안테나가 자당 솔루션으로 만져 때 그들은 더 이상 빠르고 안정적인 PER를 표시하지 않을 때까지 반복 비즈 연이어 공급하고 있습니다.
- 실험 꿀벌의 각 후속 저녁 (4-6시)에 자당 솔루션 1 소적 (4 μL, 0,88 M, 수돗물에서 해결 흰색 정제 설탕) 다른 네 번 이후를 공급하고 있습니다. 자당 솔루션 수유 동안 꿀벌의 안테나 또는 코와 튜브가 자당 솔루션으로 오염되지 않습니다 발랐습 없다는 것이 중요합니다. 꿀벌은 자당의 자극과 훈련 컨텍스트와 연결의 가능성을 제외하기 위해 에어컨의 사이트에서 또는 근처에 공급되지 않습니다.
5. 무력화 꿀벌이 숙박 유지
- 꿀벌은 상온에서 플라스틱 그릇에 하룻밤 보관됩니다. 수돗물은 그릇 (약 0,5-1 cm 높이)로 가득 차 있습니다. 무력화 꿀벌과 랙은 플랫폼으로 엘리사 플레이트를 사용하여 워터 위의 그릇에 배치됩니다. 마지막으로, 그릇은 종이로 덮여 있습니다.
6. 후각 컨디셔닝
실험의 첫 아침 (오전 10시)에서 후각 시설이 수행됩니다. 에어컨 자극 (CS)가 냄새이며, 무조건 자극 (미국)는 자당 솔루션입니다.
- 냄새 (예 : 클로브 오일) 4 μL 그 다음 20 ML의 주사기에 삽입되는 원형 여과지 (1,3 cm 직경)에 pipetted 있습니다. 냄새는 후드 아래에 pipetted하고 필터 팁는 피펫의 오염을 방지하는 데 사용됩니다.
- 무력화 꿀벌과 랙은 에어컨 절차가 시작되기 전에 에어컨 사이트 30 분 근처에 위치하지만, 거리에서 하나의 꿀벌이 에어컨 아르 배기 파이프 앞에있는 곳으로. 것입니다
- 에어컨은 10 분 간 재판 간격 (ITI) 세 냄새의 pairings (에어컨 자극, CS)과 자당 솔루션 (무조건 자극, 미국, 1,25 M)으로 구성되어 있습니다. 오디오 플레이어를 통해 실험자에게 전달 음향 신호는 자극 발병, 자극 오프셋, 자극 기간 및 배치의 정확한 타이밍을 보장합니다. 인수 재판은 배기 앞에서 동물의 10 초 배치와 함께 시작합니다. 곧 10 초이 끝나기 전에 그 냄새를 포함하는 주사기는 꿀벌의 안테나를 대상으로 꿀벌 앞에 3cm를 배치됩니다. 이후, 그 냄새는 주사기는 20 ML 공기를 추진하여 5 초를 위해 제공됩니다. 처음 3 초 후 두 안테나의 말초 flagella는 이쑤시개, 동물은 4 초에 대한 moistend 이쑤시개 핥아 허용하는 솔루션 - moistened 자당과 함께 감동하고 있습니다. 13 초 CS의 자극 종료, 꿀벌 후 훈련 컨텍스트 밖으로 촬영하고 있으며 랙에 다시 배치. 모두 한 교육 시범 28 초 지속.
꿀벌의 안테나이나 코도이 컨디셔닝 후 자당 덮여 것이 중요합니다. 따라서 그것은 이쑤시개에만 자당 솔루션과 이쑤시개에 대한 자당 솔루션 양식의 방울없이 그 moistened 것을 보장되어야한다. - 에어컨 후 랙에은 그릇에 다시 배치됩니다.
- 실험 기간 동안 동물의 행동은, 배치 및 CS와 미국의 프레 젠 테이션 도중 PER의 발생 즉, 감시 및 실험자에 의해 아래로 지적했다.
7. 메모리 유지
- 보존 시험은 어떤 간격 (일 분)에서 수행할 수 있습니다. 메모리 테스트가 시작되기 전에 꿀벌과 랙은 에어컨 사이트 30 분 근처에 배치됩니다.
- 메모리 테스트는 미국의 프레 젠 테이션없이 5 초 CS 프레 젠 테이션으로 구성되어 있습니다. 테스트 배기 앞에서 동물의 10 초 배치와 함께 시작합니다. 위에서 설명한 후, 그 냄새는 5 초를 위해 제공됩니다. 동물의 행동은, 배치 중에 PER의 발생을 IE와 CS 프레 젠 테이션은 실험 기간 동안 아래 기록됩니다.
- 실험의 끝에 코 엑스텐션 응답이 다시 동물이 여전히 코를 확장할 수 있는지 확인하기 위해 자당 솔루션 안테나를 만져 elicited 수 있습니다.
8. 체계적 사출
체계 분사의 시점은 실험 설계에 따라 달라집니다.
- 작은 구멍은 일회용 피하 바늘 (21 G)를 사용하여 비행 근육 17 위 scutal 터지게 옆에있는 순판의 후부 부분 cuticula에서 이루어집니다.
- 유리 모세관을 사용, 1 μL 솔루션은 비행 근육에 cuticula에있는 구멍을 통해 주입합니다. 숙련된 경험은 분사와 컨디셔닝의 정확한 타이밍을 수 있도록, 매 30 초 벌 한 삽입할 수 있습니다.
9. 실험을 진행하는 동안 수유 꿀벌
- 에어컨 후 저녁 (4-6시)에, 꿀벌은 자당 솔루션 1 소적 (4 μL, 0,88 M, 수돗물에 녹아있는 흰색 정제 설탕) 다른 네 번 이후를 공급하고 있습니다. 자당 솔루션 수유 동안 꿀벌의 안테나 또는 코와 튜브가 자당 솔루션으로 오염되지 않습니다 발랐습 없다는 것이 중요합니다. 꿀벌은 자당의 자극과 훈련 컨텍스트와 연결의 가능성을 제외하기 위해 에어컨의 사이트에서 또는 근처에 공급되지 않습니다.
10. 데이터 수집 및 데이터 분석
- 실험 중에 코 확장 반응의 발생이 모니터링됩니다. 그것이 오픈 mandibles 사이에 가상 선을 넘어, CS의 발병과 미국의 프레 젠 테이션 (훈련 중에) 사이 또는 CS 프리젠 테이션 (시험 단계 동안) 동안의 코를 확장하면 벌은 긍정적인 점수입니다.
- 분석 동물에 포함되는 것은이 기준을 충족해야합니다 : 그들은 모든 실험을 생존해야하며 그들은 실험 끝에 자당 솔루션에 무조건 코 확장 응답 (당) 표시해야합니다. 획득 및 유지 시험 동안 PER를 보여주는 꿀벌의 비율은 각 CS 프레 젠 테이션을위한 꾸몄다입니다.
11. 대표 결과 :
두 실험이 여기에 표시됩니다.
첫 번째 실험에서는 인산염 버퍼 호수 (PBS의 체계 주입의 영향을 봐;의 MM : 137 NaCl, KCl 2,7, 10,1 나 2 HPO 4, 1,8 KH 2 PO 4, 산도 7 2) 학습과 장기 기억 형성에. 꿀벌의 세 그룹이 10 분 간 재판 간격 세 CS - US pairings와 함께 훈련했다 : 비 대우 그룹, 훈련 전에 1 μL PBS 30 분 맞았 었소 그룹, 그리고 사기 - 주입 그룹 치료 PBS - 주입된 그룹으로하지만, PBS를 주입하지 않고 같은 방법으로. 훈련 메모리 후 24 H는 세 그룹으로 한 CS 프레 젠 테이션에서 테스트되었습니다. 에어컨 동안 에어컨 응답을 보여주는 동물의 비율은 세 가지 교육 실험에 걸쳐 크게 증가 (Fig.1, 팩터 시간 반복 측정 ANOVA F 2378 = 340456, P <0,05). PER에 차이 (ANOVA는 요소 그룹 F2, 189 = 1,299, P> 0,05에 대한 반복 측정을위한) 시설 중 세 그룹 사이에 관찰 수 없습니다. PBS - 주입 및 사기 - 주입 동물이 아닌 동물 취급을 비교할 때 24 H 보존 시험 (F2, 187 = 0,752, P> 0,05)에 대한 진정한 보유하고 있습니다.
두 번째 실험에서 우리는 메모리 보존 세 억제하고 단백질 합성 억제제를 anisomycin (10 MM)가 systemically 세 CS - US pairings 후 30 분 주입했습니다 훈련 후 나흘의 시간을 보여줍니다. PBS - 주입된 그룹 anisomycin - 주입된 그룹의 비교는 보존 t 동안 그룹 사이에 상당한 차이를 보여동부 표준시 (Fig.2, 요소 그룹 F1, 94에 대한 반복 측정 ANOVA = 8,86, P <0,05). 큰 차이는 일 3 일 4 메모리 테스트에서 볼 수 있습니다. 이것은 Wüstenberg 외의 결과 유사합니다. 18도 다른 프로토콜과 함께이라도 세 CS - US pairings와 꿀벌을 갖추 사람.
그림 1. Cuticula의 장애 또는 PBS의 분사가 수집 및 메모리 보존을 변경하지 않습니다. 동물 세 CS - US의 pairings (인수)와 함께 훈련했다. 24 H 후, 메모리 (메모리 유지) 테스트되었습니다. 훈련하기 전에 30 분은 구멍이 두 그룹의 cuticula에서 만들어진 (병변, PBS)와 이러한 그룹 중 하나는 1 μL PBS (PBS)에 주입했다. 세 번째 그룹은 (NO 치료) 그대로 유지했다. 발표는 각 그룹 당과 냄새 프레 젠 테이션에 대한 대처 방법에 대한 동물의 비율입니다. ANOVA는 수집 단계에서 그룹 사이에 큰 차이를 밝혀 (F2, 189 = 1.299, P> 0.05) 또는 메모리에 보존 (F2, 187 = 0.752, P> 0.05)하지 않습니다.
그림 2. 마지막 CS - US의 페어링 후 anisomycin 40 분의 분사는 메모리 보존 사흘 사일 훈련 후을 줄일 수 있습니다. 동물은 세 CS - US의 pairings (인수)와 훈련 1 μL 10 MM anisomycin (Aniso) 또는 1 μL PBS로 주입되었다 첫 번째 훈련 시험 후 1 H. 메모리 (메모리 유지) 24 H 48 H 나중에, 72 H 및 96 H를 테스트했습니다. 제시하면 PER과 냄새 프레 젠 테이션에 응답 그룹당 동물의 비율입니다. anisomycin의 주입은 훈련 후에 메모리를 유지하고 72 H 96 H의 상당한 감소 (F1, 94 = 8.86, P는 <0.05)로 ANOVA에 의해 공개로 연결됩니다.
Discussion
- 꿀벌 잡기 : 경험이 풍부한 식량 약탈을 배워 꿀벌을 수집하려면, 꿀벌은 젊은 꿀벌은 오리 엔테이션 항공편 19에있는 시간을 피하기 위해, 아침이나 오후에 들키지 수 있습니다. Foragers는 화분이나 꿀을 중 하나를 수집합니다. 꽃가루와 꿀은의 foragers 차이들은 설탕 응답과 학습 능력에 따라 20 관찰되었습니다. 단 넥타 foragers을 잡기 위해서, 자당 솔루션으로 가득 인공 음식 소스가 벌통과 동물 근처에 설치할 수있는 거기 수집하실 수 있습니다. 하이브로 돌아가고 꽃가루 foragers들은 뒷다리로 20 꽃가루 바구니에서 확인할 수 있습니다.
- 고정 및 처리 : 그것은 실험이 끝날 때까지 배우와 생존 능력에 영향을 미칠 수 있기 때문에 얼음에 꿀벌의 확장 냉각은 피해야한다. Tarsi은 자당 솔루션 실수로 자극을 피하기 위해 튜브 내에서 신중하게 고정해야합니다. 꿀벌이 succrose 솔루션 3,21와 tarsal 자극에 의해 배울 표시 되었기 때문에 이것은 중요합니다.
- 후각 에어컨 : 에어컨 재판의 번호가, 남북 재판 간격 및 테스트 시점이 연구 3,22의 초점에 따라 다양한하실 수 있습니다.
- 먹이 : 꿀벌의 포만 수준이 학습 성능과 메모리 보존 3,23 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다. 이것은 실험을 계획 할 때 고려되어야한다.
- 사출 : 에어 주머 니나는 꿀벌의 흉부의 17에 위치하고 있습니다. 호흡 시스템의 이러한 중요한 부분은 생존을 위해 필요합니다. 그러므로주의를 주입하는 동안 공기 주머 니나을 손상하지 않도록해야합니다. 기포의 릴리스는 공기 주머 니나에 손상을 나타냅니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
DE 배우기 (BFNL)의의 연결을 기초 우리는 원고의 이전 버전에 대한 귀중한 의견을 란돌프 멘젤 감사합니다 :이 작품은 교육 및 번스타인 초점 내에서 연구 (BMBF)의 독일 연방 교육부에서 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syringe Omnifix 20 ml | B. Braun Medical | 4616200 V | |
| White refined household sugar | Kaisers Supermarket, Berlin, Germany | ||
| Clove oil | Bombastus, Freital, Germany | ||
| Multipette plus | Eppendorf | 4981 000.019 | |
| Rack for 30 bee tubes | Home made | ||
| Plastic tubes | Home made | ||
| UV light-permeable plexiglass pyramid | Home made | height = 30cm,apex 3.5 x 3.5cm,base 18x18cm | |
| Sticky tape | Tesa, Hamburg, Germany | ||
| Capillator sticks 1-5μl | Selzer | ||
| Capillator tips 1-5μl | Selzer | ||
| Filter paper 0.16-0.2 mm thick | Macherey-Nagel | MN 616 or MN615 | Adjusted to circular pieces with a 1.3 cm diameter |
| Disposable hypodermic needle | B. Braun Medical | 4657683 | 0.45 mm diameter |
References
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