Summary
אנו מדגימים כיצד ליישם שיטה פרמקולוגיה התנהגותיים לפרדיגמה מיזוג תיאבון הריח של דבורים (אפיס מליפרה) על ידי יישום מערכתי של תרופות. שיטה זו מאפשרת חקירה של מנגנוני הלמידה הבסיסית היווצרות הזיכרון בצורה פשוטה ואמינה.
Abstract
דבורי דבש (אפיס מליפרה) ידועים התקשורת שלהם ומיומנויות התמצאות מרשימה עבור 1,2 יכולת הלמידה שלהם. כי ההישרדות של מושבת הונאיבי תלוי בניצול של מקורות המזון, דבורים מלקט ללמוד לשנן אתרי פרח משתנה, כמו גם את הרווחיות שלהם. דבורים מלקט ניתן לאמן בקלות בסביבה טבעית שבה הם לנבור באתר האכלה וללמוד את האותות נלווים כגון ריח או צבע. למידה אסוציאטיבית תיאבון יכול להיות גם למד בתנאים מבוקרים במעבדה על ידי מיזוג התגובה הרחבה חוטם (PER) של דבורי דבש רתם בנפרד 3,4. זו פרדיגמה למידה המאפשרת לימוד של מנגנוני עצבית מולקולרית העומדים בבסיס הלמידה היווצרות הזיכרון בצורה פשוטה ואמינה מאוד 5-12. גישה פרמקולוגיה התנהגותית משמש ללמוד המנגנונים המולקולריים. סמים מוזרקים מערכתית להפריע לתפקוד של מולקולות ספציפיות במהלך או לאחר למידה היווצרות הזיכרון 13-16.
כאן אנו מדגימים כיצד לאמן דבורים לרתום מיזוג PER וכיצד ניתן ליישם תרופות מערכתית בזריקה לתוך השריר טיסה דבורה.
Protocol
1. לתפוס דבורים מן הכוורת
- יום אחד לפני הניסוי מתחיל, בין 2 ל 4:00, דבורים לעזוב את הכוורת נתפסים. כדי לעשות זאת, פרספקס UV אור חדיר פירמידה (גובה = 30 ס"מ, איפקס 3,5 x 3, 5 ס"מ, בסיס 18 x 18 ס"מ), אשר closable בפסגת ובסיס, הוא החזיק ב 20 - במרחק 30 ס"מ מול הכניסה כוורת עם בסיס פתוח שיא סגור כל כך לעזוב את כוורת הדבורים להזין את בסיס הפירמידה. בסיס סגור אז הדבורים שנתפסו מובאים למעבדה להמשך טיפול.
2. העברת דבורים מן הפירמידה לתוך צלוחיות זכוכית
- במעבדה, הפירמידה ממוקמת על בסיסו. הקירות של הפירמידה הם חשוכים (למשל עם מגבת) אבל שיא נשאר חשוף. בגלל phototaxis חיובי שלהם, דבורים יעזוב את הפירמידה דרך הקודקוד כאשר נפתח. אחד אחד, דבורים מועברים הפירמידה לתוך צלוחיות זכוכית ידי החזקת בקבוקונים על הקודקוד הפתוח. בקבוקון אחד משמש לכל דבורה. לכן, איפקס נסגר כאשר הדבורה נכנסת בקבוקון.
3. רתימת דבורים צינורות
- דבורים הם משותקים על ידי קירור אותם צלוחיות זכוכית על קרח דק 2.5-3.5. מומלץ לצפות דבורה להסיר אותו מן הקרח ברגע שהוא מפסיק לזוז.
- דבורה משותקת יחיד הוא רתום בתוך שפופרת פלסטיק קטנה עם סרט דביק, כך הוא מסוגל לנוע בחופשיות חוטם שלה אבל לא, הראש החזה או הרגליים. חשוב הצוואר אינו דחוס.
- דבורה כל קבוע צינור הפלסטיק מוכנס לתוך הקידוח ממוספרים על מדף לטיפול טוב יותר הזדהות. אחרי זה הוסר לאחזור מיזוג או זיכרון הצינור הוא חזר תמיד אל הקידוח בדיוק.
4. האכלת דבורים
- בערב הראשון (4-6 בערב), לאחר שנתפס, דבורים ניזונים לשובע עם פתרון סוכרוז (0,88 מ ', הבית הלבן סוכר מזוקק מומס במי ברז). כדי להאכיל דבורה, PER שלה הוא עורר על ידי נגיעה האנטנות שלה עם פתרון סוכרוז החיה מותר לצרוך לטיפה אחת (4 μL) של תמיסת סוכרוז. דבורים ניזונים אחד אחרי השני שוב ושוב עד שהם כבר לא מראים מהיר ואמין PER כאשר האנטנות שלהם נגע עם פתרון סוכרוז.
- בערב אחד לאחר מכן (4-6 בערב) של הדבורים הניסוי ניזונים בזו אחר זו ארבע פעמים עם 1 טיפה של תמיסת סוכרוז (4 μL, 0,88 מ ', סוכר לבן מזוקק לפתור במי ברז). חשוב כי פתרון סוכרוז אינו מרוח על האנטנות של הדבורה או חוטם במהלך האכלה כי הצינורות אינם מזוהמים פתרון סוכרוז. דבורים לא צריך להיות מוזן ליד או באתר מיזוג לשלול את האפשרות של שיוך ההקשר אימון עם גירוי סוכרוז.
5. שמירה על דבורים רתומים לינה
- דבורים נשמרים לילה בטמפרטורת החדר בקערת פלסטיק. מי ברז מלא לתוך הקערה (כ 0,5-1 ס"מ גובה). Racks עם הדבורים רתם מונחות בקערה מעל פני המים באמצעות פלטות ELISA כפלטפורמה. לבסוף, הקערה מכוסה קרטון.
6. חוש הריח מיזוג
בבוקר הראשון (10:00) של הניסוי מיזוג ההרחה מתבצעת. גירוי מותנה (CS) הוא ריח, את הגירוי הבלתי מותנה (ארה"ב) הוא פתרון סוכרוז.
- 4 μL של ריח (שמן ציפורן למשל) הם pipetted על נייר סינון עגול (1,3 ס"מ קוטר) אשר מוכנס מכן לתוך מזרק 20 מ"ל. הריח הוא pipetted מתחת למכסה המנוע וטיפים לסנן משמשים על מנת למנוע זיהום של פיפטה.
- מתלה עם דבורים רתם ממוקם ליד אתר 30 דקות לפני מיזוג הליך מיזוג מתחיל, אבל במרחק למקום מול צינור הפליטה שם דבורים יחיד מותנים.
- מיזוג מורכב משלושה זיווגים של ריח (גירוי מותנה, CS) פתרון סוכרוז (הגירוי הבלתי מותנה, ארה"ב, 1,25 M) עם מרווח בין משפט (ITI) של 10 דקות. אות אקוסטי נמסר הניסוי באמצעות נגן האודיו מבטיח את העיתוי המדויק של תחילת הגירוי, הגירוי אופסט, משך הגירוי הצבת. משפט הרכישה מתחיל עם מיקום 10 שניות של החיה מול פליטה. זמן קצר לפני תום 10 שניות מזרק המכיל את ריח ממוקם 3 ס"מ מול הדבורה מכוון האנטנות של הדבורה. לאחר מכן, ריח מוצגת למשך 5 שניות, על ידי דחיפת האוויר 20 מ"ל באמצעות המזרק. אחרי הראשון 3 שניות שוטונים דיסטלי של אנטנות הן נגע עם סוכרוז פתרון, לחלח קיסם וחיות מותר ללקק את קיסם moistend למשך 4 שניות. 13 שניות לאחר סיום גירוי CS, דבורים מהקשרם האימונים והניח בחזרה במעמד. בסך הכל משפט אחד ההכשרה נמשכת 28 שניות.
חשוב גם אנטנות של הדבורה ולא חוטם מכוסים סוכרוז לאחר מיזוג. לכן זה חייב להיות להבטיח כי קיסם רק טבולה פתרון סוכרוז וזה לא טיפות הטופס סוכרוז פתרון הקיסם. - לאחר מיזוג המדפים מוצבים בחזרה בקערה.
- התנהגותם של בעלי החיים במהלך הניסוי, כלומר, את המופע של PER במהלך השמה CS והצגת בארה"ב, מנוטר וציין על ידי הנסיין.
7. זיכרון שייר
- בדיקות שייר יכול להתבצע במרווח כלשהו (דקות עד ימים). מתלה עם דבורים ממוקם ליד אתר 30 דקות לפני מיזוג במבחן הזיכרון מתחיל.
- מבחן זיכרון מורכב מצגת CS 5 שניות בלי מצגת בארה"ב. המבחן מתחיל עם מיקום 10 שניות של החיה מול הפליטה. לאחר מכן, ריח מוצגת למשך 5 שניות כפי שתואר לעיל. ההתנהגות של בעל החיים, כלומר את המופע של PER במהלך השמה את המצגת CS הוא רשם במהלך הניסוי.
- בסוף הניסוי התגובה extention חוטם הוא שוב עורר ידי נגיעה אנטנות עם פתרון סוכרוז על מנת להבטיח כי בעל החיים הוא עדיין מסוגל להאריך חוטם שלה.
8. הזרקת מערכתית
נקודת הזמן של הזרקת מערכתית תלוי בתכנון הניסוי.
- חור קטן הוא עשה cuticula של החלק האחורי של scutum ליד הסדק scutal מעל 17 הטיסה השריר באמצעות מחט המזרק חד פעמיות (21 G).
- באמצעות צינור זכוכית נימי, 1 פתרון μL מוזרק דרך החור cuticula לתוך השריר הטיסה. הנסיינים מאומנים מסוגלים להזריק דבורה אחת בכל 30 שניות, מה שמאפשר תזמון מדויק של הזרקת אוויר.
9. האכלת דבורים במהלך הניסוי
- בערב (4-6 בערב), לאחר מיזוג, דבורים ניזונים בזו אחר זו ארבע פעמים עם 1 טיפה של תמיסת סוכרוז (4 μL, 0,88 מ ', סוכר לבן מזוקק מומס במי ברז). חשוב כי פתרון סוכרוז אינו מרוח על האנטנות של הדבורה או חוטם במהלך האכלה כי הצינורות אינם מזוהמים פתרון סוכרוז. דבורים לא צריך להיות מוזן ליד או באתר מיזוג לשלול את האפשרות של שיוך ההקשר אימון עם גירוי סוכרוז.
10. איסוף נתונים וניתוח נתונים
- המופע של התגובה הרחבה חוטם במהלך הניסוי מנוטר. דבורה הוא הבקיע חיובי אם זה מרחיב חוטם שלו בין תחילת CS והצגת בארה"ב (במהלך אימון) או במהלך המצגת CS (בשלב הבדיקה), חציית קו וירטואלי בין הלסתות פתוח.
- כדי להיכלל החיות ניתוח למלא שני קריטריונים: הם חייבים לשרוד את הניסוי כולו והם חייבים להראות את התגובה הארכה מותנית חוטם (PER) לפתרון סוכרוז בסוף הניסוי. אחוז דבורים מראה את PER במהלך הרכישה בדיקות השמירה היא להתוות עבור כל מצגת CS.
11. נציג תוצאות:
שני הניסויים מוצגים כאן.
בניסוי הראשון נבחן את ההשפעה של הזריקה מערכתית של פוספט בופר סליין (PBS; במ"מ: 137 NaCl, KCl 2,7, 10,1 Na 2 HPO 4, 1,8 KH 2 PO 4, pH 7, 2) על למידה לטווח ארוך היווצרות הזיכרון. שלוש קבוצות של הדבורים אומנו עם שלושה CS-US זיווגים עם מרווח בין משפט של 10 דקות: קבוצת שאינם מטופלים, קבוצה הזריקו 1 דקות μL 30 PBS לפני האימון, וקבוצת המזויף, מוזרק התייחסו באותו אופן כמו קבוצה PBS-הזריקו אך ללא הזרקת PBS. 24 שעות לאחר האימון נבדק זיכרון עם מצגת CS אחד כל שלוש הקבוצות. אחוז בעלי מראה את התגובה המותנית במהלך מיזוג מגדילה באופן משמעותי על פני שלושה ניסויים הכשרה (תמונה 1, ANOVA למדידת חזר בפעם גורם F 2378 = 340456, p <0,05). אין הבדל ב PER יכול להיבחן בין שלוש קבוצות במהלך מיזוג (ANOVA למדידת חוזרות ונשנות של הקבוצות גורם F2, 189 = 1299, p> 0,05). זה נכון גם לגבי מבחן 24 שעות שמירה (F2, 187 = 0752, p> 0,05) כאשר משווים שאינם מטופלים חיות עם PBS-מוזרק חיות דמה, מוזרק.
בניסוי השני אנו מדגימים את עיכוב של שימור הזיכרון שלושה ארבעה ימים לאחר האימון כאשר סינתזת החלבון מעכב anisomycin (10 mM) שהוזרק מערכתית 30 דקות לאחר שלוש CS-US זיווגים. השוואה בין קבוצה anisomycin-מוזרק עם קבוצת PBS-מוזרק מגלה הבדל משמעותי בין הקבוצות במהלך t השמירהest (Fig.2, ANOVA למדידת חוזרות ונשנות של גורם בקבוצה F1, 94 = 8,86, p <0,05). ההבדל העיקרי ניתן לצפות במבחן הזיכרון ביום 3 יום 4. זה דומה לתוצאות Wüstenberg et al. 18, אשר מותנה גם דבורים עם שלושה CS-US זיווגים, אם כי עם פרוטוקול שונה.
באיור 1. הנגע Cuticula או הזרקה של PBS אינו משנה רכישה ושימור הזיכרון. חיות הוכשרו עם זיווגים three CS-US (רכישה). לאחר 24 שעות, זיכרון נבדק (שימור זיכרון). שלושים דקות לפני האימון, חור נעשה cuticula של שתי הקבוצות (הנגע, PBS) ואחד של קבוצות אלה הזריקו 1 PBS μL (PBS). קבוצה שלישית נותר ללא שינוי (ללא טיפול). המוצג הינו אחוז בעלי חיים עבור כל קבוצה להגיב מצגת עם ריח PER. ANOVA אינם חושפים שום הבדלים משמעותיים בין הקבוצות בשלב הרכישה (F2, 189 = 1.299, p> 0.05) או שימור הזיכרון (F2, 187 = 0.752, p> 0.05).
איור 2. הזרקה של 40 דקות anisomycin לאחר זיווג CS-US האחרון מפחית שימור הזיכרון שלושה ימים וארבעה ימים לאחר האימון. חיות הוכשרו עם זיווגים three CS-US (רכישה) ו הזריקו 1 μL 10 mM anisomycin (Aniso) או 1 PBS μL 1 שעות לאחר הניסוי האימונים הראשון. זיכרון נבדק (שימור זיכרון) 24 שעות, 48 שעות, 72 שעות ו - 96 שעות מאוחר יותר. מוגש הוא אחוז לכל קבוצה של בעלי חיים מגיבים מצגת עם ריח PER. הזרקה של anisomycin מוביל לצמצום משמעותי של שימור זיכרון 72 שעות ו - 96 שעות לאחר האימון (F1, 94 = 8.86, p <0.05), כפי שהיא מתגלה על ידי ANOVA.
Discussion
- לתפוס דבורים: כדי לאסוף דבורים ליקוט מנוסה, דבורים נתפסים או בבוקר או בשעות אחר הצהריים, הימנעות הזמן שבו דבורים צעירות בטיסות אוריינטציה 19. מלקטי מזון או לאסוף אבקה או צוף. הבדלים בין אבקה מלקטי מזון צוף נצפו על פי ההיענות הסוכר שלהם ויכולות הלמידה שלהם 20. על מנת לתפוס מלקטי מזון צוף בלבד, מקור מזון מלאכותי מלא עם פתרון סוכרוז ניתן להתקין ליד הכוורת וחיות ניתן לאסוף שם. מלקטי מזון אבקה לחזור לכוורת ניתן לזהות על ידי בסלי האבקה על הרגליים האחוריות שלהם 20.
- תיקון וטיפול: קירור מורחבת של דבורים על הקרח יש להימנע כי זה עלול להשפיע על היכולת שלהם ללמוד לשרוד עד סוף הניסוי. טרסי צריך להיות קבוע בזהירות בתוך הצינור, כדי למנוע גירוי מקרי עם פתרון סוכרוז. זה חשוב, כי דבורים הוכחו ללמוד ידי גירוי tarsal עם פתרון succrose 3,21.
- מיזוג חוש הריח: מספר ניסויים מיזוג, רווח בין משפט לבין נקודת זמן הבדיקה יכולים להיות מגוונים בהתאם מוקד המחקר 3,22.
- האכלה: רמת השובע של דבורים ידוע להשפיע על הביצועים שלהם למידה ושימור הזיכרון 3,23. זה חייב להילקח בחשבון כאשר מתכננים את הניסויים.
- הזרקה: שקי האוויר ממוקמים 17 החזה דבורת דבש. אלו חלקים חיוניים של מערכת הנשימה נחוצות להישרדות. לכן יש להיזהר לא לפגוע נאדיות במהלך ההזרקה. שחרורו של בועות אוויר מציין נזק נאדיות.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם המשרד הפדרלי הגרמני לחינוך ולמחקר (BMBF) בתוך פוקוס ברנשטיין: הבסיס העצבי של למידה (BFNL) כדי DE אנו מודים רנדולף Menzel על הערות מועילות על גרסה מוקדמת של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syringe Omnifix 20 ml | B. Braun Medical | 4616200 V | |
| White refined household sugar | Kaisers Supermarket, Berlin, Germany | ||
| Clove oil | Bombastus, Freital, Germany | ||
| Multipette plus | Eppendorf | 4981 000.019 | |
| Rack for 30 bee tubes | Home made | ||
| Plastic tubes | Home made | ||
| UV light-permeable plexiglass pyramid | Home made | height = 30cm,apex 3.5 x 3.5cm,base 18x18cm | |
| Sticky tape | Tesa, Hamburg, Germany | ||
| Capillator sticks 1-5μl | Selzer | ||
| Capillator tips 1-5μl | Selzer | ||
| Filter paper 0.16-0.2 mm thick | Macherey-Nagel | MN 616 or MN615 | Adjusted to circular pieces with a 1.3 cm diameter |
| Disposable hypodermic needle | B. Braun Medical | 4657683 | 0.45 mm diameter |
References
- Menzel, R., Giurfa, M. Cognitive architecture of a mini-brain: the honeybee. Trends Cogn Sci. 5, 62-71 (2001).
- Menzel, R., Leboulle, G., Eisenhardt, D. Small brains, bright minds. Cell. 124, 237-239 (2006).
- Menzel, R. Neurobiology of comparative cognition. Kesner, R. P., Olton, D. S. , Lawrence Erlbaum Associates Publishers. Hillsday, New Jersey, Hove, London. (1990).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. Classical-Conditioning of Proboscis Extension in Honeybees (Apis-Mellifera). J. Comp. Psyc. 97, 107-119 (1983).
- Menzel, R., Muller, U. Learning and memory in honeybees: from behavior to neural substrates. Annu. Rev. Neurosci. 19, 379-404 (1996).
- Menzel, R. Memory dynamics in the honeybee. Journal of Comparative Physiology A-Neuroethology Sensory Neural and Behavioral Physiology. 185, 323-340 (1999).
- Menzel, R. Searching for the memory trace in a mini-brain, the honeybee. Learn. Mem. 8, 53-62 (2001).
- Eisenhardt, D. Learning and memory formation in the honeybee (Apis mellifera) and its dependency on the cAMP-protein kinase A pathway. Animal Biology. 56, 259-278 (2006).
- Hourcade, B., Muenz, T. S., Sandoz, J. C., Rossler, W., Devaud, J. M. Long-term memory leads to synaptic reorganization in the mushroom bodies: a memory trace in the insect brain. J. Neurosci. 30, 6461-6465 (2010).
- Denker, M., Finke, R., Schaupp, F., Grun, S., Menzel, R. Neural correlates of odor learning in the honeybee antennal lobe. Eur. J. Neurosci. 31, 119-133 (2010).
- Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. Associative and non-associative plasticity in kenyon cells of the honeybee mushroom body. Front Syst. Neurosci. 2, 3-3 (2008).
- Okada, R., Rybak, J., Manz, G., Menzel, R. Learning-related plasticity in PE1 and other mushroom body-extrinsic neurons in the honeybee brain. J. Neurosci. 27, 11736-11747 (2007).
- Muller, U. Prolonged activation of cAMP-dependent protein kinase during conditioning induces long-term memory in honeybees. Neuron. 27, 159-168 (2000).
- Locatelli, F., Bundrock, G., Muller, U. Focal and temporal release of glutamate in the mushroom bodies improves olfactory memory in Apis mellifera. J. Neurosci. 25, 11614-11618 (2005).
- Stollhoff, N., Menzel, R., Eisenhardt, D. Spontaneous recovery from extinction depends on the reconsolidation of the acquisition memory in an appetitive learning paradigm in the honeybee (Apis mellifera. J. Neurosci. 25, 4485-4492 (2005).
- Stollhoff, N., Eisenhardt, D. Consolidation of an extinction memory depends on the unconditioned stimulus magnitude previously experienced during training. J. Neurosci. 29, 9644-9650 (2009).
- Snodgrass, R. E. Anatomy of the honeybee. , Comstock Publishing Associates. New York. (1956).
- Wustenberg, D., Gerber, B., Menzel, R. Short communication: long- but not medium-term retention of olfactory memories in honeybees is impaired by actinomycin D and anisomycin. Eur. J. Neurosci. 10, 2742-2745 (1998).
- Vollbehr, J. Zur Orientierung junger Honigbienen bei ihrem 1. Orientierungsflug. Zool. Jb. Physiol. 79, 33-69 (1975).
- Scheiner, R., Erber, J., Page, R. E. Tactile learning and the individual evaluation of the reward in honey bees (Apis mellifera L.). J. Comp Physiol [A]. 185, 1-10 (1999).
- Sanchez, B. rito, G, M. Behavioral studies on tarsal gustation in honeybees: sucrose responsiveness and sucrose-mediated olfactory conditioning. J. Comp Physiol A Neuroethol. Sens. Neural Behav. Physiol. 194, 861-869 (2008).
- Menzel, R., Manz, G., Menzel, R., Greggers, U. Massed and spaced learning in honeybees: the role of CS, US, the intertrial interval, and the test interval. Learn. Mem. , 198-208 (2001).
- Friedrich, A., Thomas, U., Muller, U. Learning at different satiation levels reveals parallel functions for the cAMP-protein kinase A cascade in formation of long-term memory. J. Neurosci. 24, 4460-4468 (2004).
