Summary
Nous démontrons comment mettre en œuvre une méthode pharmacologie comportementale dans un paradigme de conditionnement olfactif appétitif chez les abeilles (Apis mellifera) par application systémique de médicaments. Cette méthode permet l'étude des mécanismes sous-jacents de l'apprentissage et la formation de la mémoire d'une manière simple et fiable.
Abstract
Les abeilles domestiques (Apis mellifera) sont bien connus pour leurs compétences de communication et d'orientation et de leur capacité d'apprentissage 1,2 impressionnante. Parce que la survie d'une colonie d'abeilles dépend de l'exploitation des sources de nourriture, les abeilles butineuses apprendre et mémoriser les sites de fleurs variable ainsi que leur rentabilité. Butineuses peuvent être facilement entraînés dans un cadre naturel où ils fourrages à un site d'alimentation et d'apprendre les signaux liés tels que l'odeur ou la couleur. Appétitive apprentissage associatif peut aussi être étudié sous des conditions contrôlées en laboratoire par le conditionnement de la réponse d'extension proboscis (PER) de 3,4 individuellement exploité abeilles. Ce paradigme de l'apprentissage permet l'étude des mécanismes neuronaux et moléculaires qui sous-tendent l'apprentissage et la formation de la mémoire d'une manière simple et très fiable 5-12. Une approche pharmacologie comportementale est utilisée pour étudier les mécanismes moléculaires. Les médicaments sont injectés par voie systémique d'interférer avec la fonction de molécules spécifiques pendant ou après l'apprentissage et 13-16 formation de la mémoire.
Ici nous démontrons comment former les abeilles exploitée dans le conditionnement PER et comment appliquer la drogue systémique par injection dans le muscle de vol des abeilles.
Protocol
1. Attraper les abeilles de la ruche
- Un jour avant l'expérience commence, entre 2 et 16 heures, laissant les abeilles de la ruche sont capturés. Pour ce faire, une pyramide en plexiglas lumière UV-perméable (hauteur = 30 cm, apex 3,5 x 3, 5 cm, base 18 x 18 cm), qui peut être fermée à l'apex et la base, est maintenu à un 20 - 30 cm de distance en face de l'entrée de la ruche avec la base et d'ouvrir l'apex fermé afin que les abeilles de la ruche en laissant entrer dans la base de la pyramide. La base est alors fermé et les abeilles capturées sont introduits dans le laboratoire pour traitement ultérieur.
2. Transfert des abeilles de la Pyramide dans des flacons de verre
- Dans le laboratoire, la pyramide est placé sur sa base. Les murs de la pyramide sont assombris (par exemple avec une serviette), mais l'apex est laissé à découvert. En raison de leur phototaxie positive, les abeilles vont quitter la pyramide par le sommet lorsqu'il est ouvert. Un par un, les abeilles sont transférés de la pyramide dans des flacons en verre en tenant le flacon au cours de l'apex ouvert. Un flacon est utilisé par abeille. Par conséquent, le sommet est fermé lorsque l'on pénètre dans le flacon abeille.
3. Exploiter les abeilles dans les tubes
- Les abeilles sont immobilisés en les refroidissant dans les flacons de verre sur la glace pour 02.05 à 03.05 min. Il est conseillé de regarder l'abeille et l'enlever de la glace dès qu'il cesse de bouger.
- Une seule abeille immobilisée est exploitée dans un petit tube en plastique avec du ruban adhésif, tel qu'il est capable de se déplacer librement mais sa trompe pas sa tête, le thorax et les jambes. Il est important que le cou n'est pas compressée.
- Chaque abeille fixée dans un tube en plastique est mis dans un trou numéroté sur une grille pour une meilleure manipulation et d'identification. Après qu'il a été enlevé pour la récupération de conditionnement ou de la mémoire du tube est toujours retourné à l'forage exactement les mêmes.
4. Abeilles alimentation
- Le premier soir (4-6 heures), après avoir été capturés, les abeilles sont nourries à satiété avec une solution de saccharose (0,88 M, sucre blanc raffiné ménages dissous dans l'eau du robinet). Pour nourrir une abeille, son PER est suscité par le toucher de ses antennes avec une solution de saccharose et de l'animal est autorisé à consommer une gouttelette (4 pi) de solution de saccharose. Les abeilles sont nourries l'une après l'autre jusqu'à ce qu'ils ne montrent plus un PER d'une rapide et fiable lorsque leurs antennes sont touchés avec une solution de saccharose.
- Sur chaque soir ultérieures (4-6 heures) des abeilles expérimentation sont nourris l'un après l'autre quatre fois avec une goutte de solution de saccharose (4 pl, 0,88 M, sucre blanc raffiné résolu dans l'eau du robinet). Il est important que la solution de saccharose n'est pas étalé sur les antennes de l'abeille ou de la trompe lors de l'alimentation et que les tubes ne sont pas contaminées avec une solution de saccharose. Les abeilles ne devraient pas être nourris à ou près du site de conditionnement d'exclure la possibilité d'associer le contexte de formation à la relance du saccharose.
5. Élevage des abeilles Harnaché Nuit
- Les abeilles sont gardées la nuit dans un bol en plastique à température ambiante. L'eau du robinet est remplie dans le bol (environ 0,5-1 cm de haut). Supports avec les abeilles exploitée sont placés dans le bol dessus de la flottaison en utilisant des plaques ELISA comme une plate-forme. Enfin, le bol est couvert avec du carton.
6. Conditionnement olfactif
Le premier matin (10 h) de l'expérience de conditionnement olfactif est effectuée. Le stimulus conditionné (CS) est une odeur, le stimulus inconditionnel (US) est solution de saccharose.
- 4 pl de l'odeur (par exemple l'huile de clou de girofle) sont à la pipette sur un papier filtre rond (1,3 cm de diamètre) qui est ensuite inséré dans une seringue de 20 ml. L'odeur est pipeté sous une hotte et pointes à filtre sont utilisés pour prévenir la contamination de la pipette.
- Le rack d'abeilles exploitée est placé à proximité du site de conditionnement 30 min avant la procédure de conditionnement commence, mais à une distance de la place en face d'un tuyau d'échappement simple où les abeilles sont conditionnés.
- Conditionnement constitué de trois paires d'odeur (le stimulus conditionné, SC) et de solution de saccharose (le stimulus inconditionné, Etats-Unis, 1,25 m) avec un intervalle inter-essai (IIT) de 10 min. Un signal acoustique livré à l'expérimentateur via un lecteur audio assure la synchronisation précise de l'apparition de relance, relance de décalage, la durée de relance et de placement. Un essai d'acquisition commence par un stage de 10 sec de l'animal en face d'un échappement. Peu avant la fin de la 10 sec la seringue contenant l'odeur est placée à 3 cm en face de l'abeille destinés aux antennes de l'abeille. Par la suite, l'odeur est présenté pendant 5 sec, en poussant l'air 20 ml par la seringue. Après le premier 3 sec les flagelles distales des deux antennes sont touchées par un sucrose solution humidifié cure-dent et les animaux sont autorisés à lécher le cure-dent moistend pendant 4 sec. 13 sec après la fin de la stimulation CS, les abeilles sont prises hors du contexte de formation et replacée dans le rack. Au total, un essai de formation dure 28 sec.
Il est important que ni l'abeille antennes, ni la trompe sont couverts avec du saccharose après conditionnement. Par conséquent, il doit être assuré que le cure-dent est seulement humidifié avec une solution de saccharose et qu'aucune forme des gouttes de solution de saccharose sur le cure-dent. - Après conditionnement les racks sont replacés dans le bol.
- Le comportement des animaux pendant l'expérience, c'est à dire l'apparition de la PER pendant le placement et le CS et la présentation des Etats-Unis, est contrôlé et noté par l'expérimentateur.
7. Rétention de mémoire
- Rétention des tests peuvent être effectués à n'importe quel intervalle (min à jour). Le rack d'abeilles est placé à proximité du site de conditionnement 30 min avant le test de mémoire commence.
- Un test de mémoire se compose de 5 sec CS présentation sans la présentation US. Le test commence par un stage de 10 sec de l'animal en face de l'échappement. Par la suite, l'odeur est présenté pendant 5 sec comme décrit ci-dessus. Le comportement de l'animal, c'est à dire l'apparition du PER au cours du placement et la présentation CS est noté pendant l'expérience.
- A la fin de l'expérience de la réponse extention proboscis est de nouveau déclenchée par toucher les antennes avec une solution de sucrose pour s'assurer que l'animal est toujours en mesure d'étendre sa trompe.
8. Injection systémique
Le point le temps d'injection systémique dépend de la conception expérimentale.
- Un petit trou est fait dans la cuticule de la partie postérieure de la scutum côté de la fissure au-dessus des 17 scutal muscles de vol en utilisant une aiguille hypodermique jetables (21 G).
- En utilisant un tube capillaire en verre, une solution est injectée à travers uL le trou dans la cuticule dans le muscle de vol. Expérimentateurs formés sont en mesure d'injecter une abeille toutes les 30 secondes, permettant une synchronisation précise de l'injection et le conditionnement.
9. Abeilles alimentation cours de l'expérience
- Dans la soirée (4-6 heures) après le conditionnement, les abeilles sont nourries l'une après l'autre quatre fois avec une goutte de solution de saccharose (4 pl, 0,88 M, sucre blanc raffiné dissous dans l'eau du robinet). Il est important que la solution de saccharose n'est pas étalé sur les antennes de l'abeille ou de la trompe lors de l'alimentation et que les tubes ne sont pas contaminées avec une solution de saccharose. Les abeilles ne devraient pas être nourris à ou près du site de conditionnement d'exclure la possibilité d'associer le contexte de formation à la relance du saccharose.
10. Collecte et analyse des données
- Présence de la réponse d'extension proboscis pendant l'expérience est surveillée. Une abeille est marqué positive si elle étend sa trompe entre le début de la CS et la présentation des États-Unis (pendant la formation) ou lors de la présentation CS (durant la phase de test), en traversant une ligne virtuelle entre les mandibules ouvertes.
- Pour être inclus dans l'analyse des animaux doit remplir deux critères: ils doivent survivre toute l'expérience et ils doivent montrer la réaction d'extension inconditionnée proboscis (PER) à la solution de saccharose à la fin de l'expérience. Le pourcentage d'abeilles montrant le PER lors de l'acquisition et de tests de rétention est tracée pour chaque présentation CS.
11. Les résultats représentatifs:
Deux expériences sont présentées ici.
Dans la première expérience nous regardons l'impact de l'injection systémique de tampon phosphate salin (PBS; en mM: NaCl 137, KCl 2,7, 10,1 Na 2 HPO 4, 1,8 KH 2 PO 4, pH 7, 2) sur l'apprentissage et la formation de la mémoire à long terme. Trois groupes d'abeilles ont été formés avec trois CS-US appariements avec un intervalle inter-essai de 10 min: un groupe non traité, un groupe qui a été injecté avec 1 ul de PBS 30 min avant l'entraînement, et un groupe témoin traité le-injectée même manière que le groupe PBS-injecté, mais sans l'injection de PBS. 24 h après la formation de la mémoire a été testé avec une présentation CS dans les trois groupes. Le pourcentage d'animaux présentant la réponse conditionnée pendant le conditionnement augmente sensiblement dans les trois essais de formation (Fig.1, ANOVA pour mesures répétées pour le facteur temps F 2378 = 340 456, p <0,05). Aucune différence en PER pouvait être observée entre les trois groupes lors du conditionnement (ANOVA pour mesures répétées pour des groupes facteur F2, 189 = 1299, p> 0,05). Cela est vrai pour un test de rétention 24 h (F2, 187 = 0752, p> 0,05) lors de la comparaison des animaux non traités avec du PBS-injecté des animaux et des sham-injecté.
Dans la deuxième expérience, nous démontrons l'inhibition de trois rétention de la mémoire et quatre jours après la formation lorsque l'inhibiteur de la synthèse des protéines anisomycine (10 mM) a été injecté par voie systémique 30 min après trois paires CS-US. Comparaison d'un groupe anisomycine-injecté avec un groupe PBS-injecté révèle une différence significative entre les groupes lors de la rétention de tEST (Fig.2, ANOVA pour mesures répétées pour le facteur groupe de F1, 94 = 8,86, p <0,05). Une différence majeure peut être observée à l'épreuve la mémoire le jour 3 et jour 4. Cela ressemble à des résultats de Wüstenberg et al. 18, qui a également conditionnée abeilles avec trois paires de CS-US, mais avec un protocole différent.
Figure 1. Lésion cutícula ou l'injection de PBS ne modifie pas l'acquisition et la rétention de la mémoire. Les animaux ont été formés avec trois paires de CS-US (d'acquisition). Après 24 h, la mémoire a été testé (Conservation de la mémoire). Trente minutes avant l'entraînement, un trou a été fait dans la cuticule des deux groupes (lésion, PBS) et un de ces groupes a été injecté avec 1 ul de PBS (PBS). Un troisième groupe a été laissée intacte (aucun traitement). Présenté est le pourcentage d'animaux de chaque groupe répondant à la présentation de l'odeur avec un PER. Une ANOVA ne révèle aucune différence significative entre les groupes de la phase d'acquisition (F2, 189 = 1,299, p> 0,05) ou de la rétention de la mémoire (F2, 187 = 0,752, p> 0,05).
Figure 2. L'injection de anisomycine 40 min après la dernière CS-US appariement réduit la rétention de la mémoire de trois jours et quatre jours après la formation. Les animaux ont été formés avec trois paires de CS-US (acquisition) et une injection de 1 uL 10 mM (Aniso) anisomycine ou 1 ul de PBS 1 h après le procès de formation d'abord. La mémoire a été testé (Rétention de mémoire) 24 h, 48 h, 72 h et 96 h plus tard. Présenté est le pourcentage d'animaux par groupe répondant à la présentation de l'odeur avec un PER. L'injection de anisomycine conduit à une réduction significative de la mémoire de rétention de 72 h et 96 h après la formation (F1, 94 = 8,86, p <0,05) tel que révélé par une analyse de variance.
Discussion
- Attraper les abeilles: Pour collecter expérimentés butineuses, les abeilles sont pris soit le matin ou l'après-midi, en évitant le temps où les jeunes abeilles sont les 19 vols d'orientation. Les butineuses recueillent le pollen ou le nectar soit. Différences entre le pollen et le nectar butineuses ont été observées en fonction de leur réactivité à sucre et de leurs capacités d'apprentissage 20. Afin d'attraper les butineuses de nectar seulement, une source de nourriture artificiel rempli avec une solution de saccharose peut être installé à proximité de la ruche et les animaux peuvent être recueillis là. Butineuses retournant à la ruche peuvent être identifiés par les corbeilles à pollen sur leurs pattes arrière 20.
- Fixation et de manutention: refroidissement prolongé des abeilles sur la glace doit être évitée car elle pourrait affecter leur capacité à apprendre et à survivre jusqu'à la fin de l'expérience. Les tarses doivent être fixés avec soin dans le tube pour éviter la stimulation accidentelle avec une solution de saccharose. Ceci est important, car les abeilles ont été montré pour apprendre par la stimulation du tarse avec une solution succrose 3,21.
- Conditionnement olfactif: Le nombre d'essais de conditionnement, l'intervalle entre les essais et le point le temps de test peut être varié en fonction de l'objectif de l'étude 3,22.
- Alimentation: Le niveau de satiété des abeilles est connue pour affecter leurs performances d'apprentissage et de rétention 3,23 mémoire. Ceci doit être pris en compte lors de la planification des expériences.
- Injection: sacs d'air sont situées dans le thorax des abeilles 17. Ces parties vitales du système respiratoire sont nécessaires pour la survie. Ainsi il faut prendre soin de ne pas endommager les sacs d'air pendant l'injection. La libération de bulles d'air indique endommager les sacs aériens.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention du ministère fédéral allemand de l'Education et la Recherche (BMBF) dans la Focus Bernstein: bases neuronales de l'apprentissage (BFNL) à DE Nous remercions Randolf Menzel pour leurs précieux commentaires sur une version antérieure du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syringe Omnifix 20 ml | B. Braun Medical | 4616200 V | |
| White refined household sugar | Kaisers Supermarket, Berlin, Germany | ||
| Clove oil | Bombastus, Freital, Germany | ||
| Multipette plus | Eppendorf | 4981 000.019 | |
| Rack for 30 bee tubes | Home made | ||
| Plastic tubes | Home made | ||
| UV light-permeable plexiglass pyramid | Home made | height = 30cm,apex 3.5 x 3.5cm,base 18x18cm | |
| Sticky tape | Tesa, Hamburg, Germany | ||
| Capillator sticks 1-5μl | Selzer | ||
| Capillator tips 1-5μl | Selzer | ||
| Filter paper 0.16-0.2 mm thick | Macherey-Nagel | MN 616 or MN615 | Adjusted to circular pieces with a 1.3 cm diameter |
| Disposable hypodermic needle | B. Braun Medical | 4657683 | 0.45 mm diameter |
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