Summary
我们将演示如何实施行为药理学方法，在药物的全身应用（蜜蜂）食欲在蜜蜂的嗅觉空调范式。这种方法允许的内在机制，学习和记忆的形成一个简单而可靠的的方式的调查。
Abstract
蜜蜂（ 蜜蜂 ）是众所周知的，他们的沟通和方向技能，并为他们令人印象深刻的的学习能力1,2。由于蜜蜂殖民地的生存取决于剥削的食物来源，采集蜜蜂学习和记忆变量花景点，以及他们的盈利能力。在自然环境中采集蜜蜂可以很容易地训练他们草料喂食地点和学习相关的信号，如气味或颜色的地方。食欲联想学习，也可以研究在实验室控制的条件下下，通过调理（PER），单独利用蜜蜂3,4长鼻扩展响应。这种学习范式使5-12在一个简单，高度可靠的的方式的学习和记忆的形成背后的神经细胞和分子机制的研究。行为药理学的方法是用来研究的分子机制。药物注入系统与特定分子的功能干扰，期间或之后的学习和记忆的形成13-16。
在这里，我们展示了如何培养每空调利用蜜蜂和如何应用系统注入蜜蜂飞行的肌肉的药物。
Protocol
1。捉蜜蜂从蜂巢
- 实验开始前一天，2至下午4时，蜜蜂离开蜂房都一网打尽。要做到这一点，一个UV光透水有机玻璃金字塔（= 30厘米，先端3,5，5 × 3厘米，底座18 x 18厘米），这是在心尖区和基地的Closable，是在20日举行的高度 - 基地开放和心尖蜂巢的入口前的30厘米的距离，使蜜蜂离开蜂房进入金字塔底部封闭。然后关闭该基地，并带来拍摄的蜜蜂实验室作进一步的处理。
2。从金字塔蜜蜂转移到玻璃小瓶
- 在实验室中，金字塔是放在底座上的。金字塔的墙壁是黑暗的（如用毛巾），但发现是左心尖。由于其积极的趋光性，蜜蜂会离开金字塔的顶点时打开。一个接一个，蜜蜂转移到玻璃小瓶从金字塔开放顶点的小瓶。蜜蜂每一个小瓶。因此，Apex是封闭的，当蜜蜂进入小瓶。
3。在管治理的蜜蜂
- 蜜蜂被固定在2.5-3.5分钟冰的玻璃小瓶冷却。这是最好看蜜蜂，从冰中删除，只要它停止不动。
- 一个单一的固定蜂是利用胶带在一个小塑料管，这样，它是能够自由移动它的长鼻，但不是它的头部，胸部或腿部。重要的是，颈部是没有压缩。
- 更好的处理和识别的机架上，固定在一个塑料管每蜜蜂被放入一个编号钻孔。它已经为空调或内存检索删除后，管总是返回完全相同的钻孔。
4。饲喂蜜蜂
- 在第一天晚上（下午4:00-6:00），被抓后，蜜蜂是美联储满足蔗糖溶液（0,88男，白色的精致家庭糖溶解在自来水）。为了养活一只蜜蜂，其人均蔗糖溶液通过触摸其触角和动物是可以消耗一个液滴的蔗糖溶液（4μL）引起。蜜蜂已经厌倦了一个又一个，直到他们不再表现出快速和可靠的的每时，他们的触角与蔗糖溶液感动。
- 在随后的每次实验蜜蜂晚上（下午4:00-6:00）美联储1蔗糖溶液的液滴（4μL，0,88 M，白色的精制糖在解决自来水）后与另外四次之一。重要的是蜜蜂的天线或在喂养过程中的长鼻和涂污管不污染的蔗糖溶液，蔗糖溶液。蜜蜂不宜过饱或附近的空调网站排除的培训与蔗糖的刺激上下文关联的可能性。
5。保持利用蜜蜂隔夜
- 蜜蜂是在室温下过夜存放在一个塑料碗。自来水充入碗（约0,5-1厘米高）。利用蜜蜂的机架放置在一碗使用酶标板作为一个平台的水线以上。最后，碗是用纸板覆盖。
6。嗅觉空调
嗅觉调节，在实验的第一天早上（上午10时）进行。条件刺激（CS）是一种气味，无条件刺激（美国）的蔗糖溶液。
- 4μL的气味（如丁香油）到一个圆形滤纸（直径1,3厘米），然后将20毫升注射器插入吸管。引擎盖下的气味是吸管和过滤嘴是用来防止污染的吸管。
- 利用蜜蜂的机架放置在靠近空调的网站30分钟的调理过程开始之前，但在一定距离，以在单一的蜜蜂是空调的排气管前的地方。
- 空调由三个配对的气味（条件刺激，CS）和与审判间的间隔为10分钟（ITI）的蔗糖溶液（无条件刺激，美国，1,25中号）。通过一个音频播放器的实验者，确保声音信号的刺激发病，刺激抵消，刺激的持续时间，并把精确的计时。收购审判开始与一个10秒的动物安置在排气前。前不久结束的10秒注射器中含有的气味是摆在前面，在蜜蜂的触角有针对性的蜜蜂3厘米。随后，气味是5秒，20毫升的空气通过注射器推。第3秒后，两个天线的远端鞭毛感动与蔗糖溶液蘸牙签和动物舔时间为4秒moistend牙签。 13秒后，CS的刺激结束后，蜜蜂取出的培训方面，并放置在机架的背面。一个培训试验共持续28秒。
重要的是，无论是蜜蜂的触角也没有的长鼻蔗糖空调后覆盖。因此，必须确保，牙签只蘸蔗糖溶液，无滴，牙签上的蔗糖溶液的形式。 - 调理后的衣架被放置在碗里。
- 在实验动物的行为，即发生在放置过程中，CS和美国文稿的PER，监测，并指出实验者。
7。内存保留
- 保留测试可以在任何时间间隔（分钟到几天）。内存测试开始前，与蜜蜂的机架放置在靠近空调的网站30分钟。
- 内存测试由5秒CS如果没有美国的演示介绍。测试开始用10秒的动物安置在前面的排气。随后，气味是5秒，如上面所述。动物的行为，即在安置过程中发生的PER和CS简报指出，在实验。
- 在实验结束长鼻延伸响应再次引起与蔗糖溶液接触的触角，以确保动物仍然能够延长它的长鼻。
8。全身注射液
全身注射的时间点取决于实验设计。
- 在上述使用一次性注射针（21 G）的飞行肌肉17 scutal裂缝旁边的鳞甲后部cuticula有一个小孔。
- 使用玻璃毛细管，1μL的解决方案是通过孔注入，在进入飞行肌肉cuticula。训练有素的实验者可以注入一个蜜蜂，每30秒，允许精确定时注射液和调理。
9。在实验过程中喂养蜜蜂
- 调理后的晚上（下午4:00-6:00），蜜蜂喂1蔗糖溶液的液滴（4μL，0,88 M，白色的精制糖溶解在自来水中）后与另外四次之一。重要的是蜜蜂的天线或在喂养过程中的长鼻和涂污管不污染的蔗糖溶液，蔗糖溶液。蜜蜂不宜过饱或附近的空调网站排除的培训与蔗糖的刺激上下文关联的可能性。
10。数据收集和数据分析
- 在实验过程中出现的长鼻扩展响应监测。蜜蜂是取得了积极的，如果延伸至CS的发病和美国的演示（培训期间），或在CS演示（在测试阶段）的长鼻，穿越打开下颌骨之间的虚拟线。
- 要在分析动物的，必须符合两个条件：他们必须生存在整个实验，他们必须证明在实验结束后无条件长鼻延伸反应（PER）的蔗糖溶液。蜜蜂采集和保留测试期间表现出的PER人员的比例是绘制每个CS演示。
11。代表性的成果：
这里给出了两个实验。
在第一个实验中，我们期待在全身注射磷酸盐缓冲液（PBS的影响;在MM：137氯化钠，2,7氯化钾，10,1娜 2 HPO 4，1,8 KH 2 PO 4，pH值7， 2）对学习和长期记忆的形成。三组的蜜蜂CS - 中美三个配对试验间间隔10分钟的训练：非治疗组，1μL，PBS在训练前30分钟注射组，和假注射组治疗同样的方式，PBS注射组，但没有注射PBS。训练内存后24小时进行了测试，一个CS在所有三组的演示。在空调条件反应的动物的比例显着增加在三个培训试验（图1，为的因素，时间的反复测量方差分析F 2378 = 340456，P < 0,05）。每无差异，可以观察到三组之间在空调（ANOVA反复测量的因素群体F2，189 = 1299，P> 0.05）。这拥有一个24小时保留测试（F2，187 = 0752，P> 0.05）真正的比较时，用PBS注入和假注入动物的非治疗性的动物。
在第二个实验中，我们表现出抑制记忆保持三和四天训练后，当蛋白质合成抑制剂茴香霉素（10毫米）系统注入30分钟后，CS - 中美三个配对。茴香霉素注射组与PBS注射组比较，揭示了在保留吨之间显着性差异EST（图2，方差分析重复测量因子F1组，94 = 8,86，P <0,05）。可以观察到在3天4天的内存测试的一个主要区别。 Wüstenberg 等类似的结果。18，谁也空调蜜蜂CS -中美三个配对，尽管不同的协议。
图1。 Cuticula病变或PBS注射不会改变收购，并记忆保持。动物CS中美三个配对（收购）的培训。 24 h后，内存测试（内存保留）。一个洞前三十分钟的训练，是在两个组cuticula（病灶，PBS），这些群体之一是用1μLPBS（PBS）的注入。第三组是原封不动的（不治疗）。主办的动物是每个组每气味演示的百分比。方差分析没有透露在收购阶段群体之间的任何显着性差异（F2，189 = 1.299，P> 0.05），或保留在内存（F2，187 = 0.752，P> 0.05）。
图2。注射茴香霉素40分钟后，最后的CS美配对减少内存保留3天，4天训练后，训练与CS中美三个配对（收购）和1μL，10 mM的茴香霉素（各向异性过滤）或1μLPBS注入动物1小时后的第一次训练试验。内存测试（内存保留）24小时，48小时，72小时和96小时后。主办每组每气味介绍动物的百分比。茴香霉素注射导致的记忆保持72小时和96小时的训练后显着减少（F1，94 = 8.86，P <0.05），方差分析显示。
Discussion
- 捕捉蜜蜂：要收集经验丰富的觅食的蜜蜂，蜜蜂被发现无论是在上午或下午，避免年轻蜜蜂方向的航班19时。觅食收集无论是花粉和花蜜。已经观察到的花粉和花蜜觅食之间的差异，根据他们的血糖反应能力和他们的学习能力20。为了赶上只有花蜜觅食，与蔗糖溶液填充一个人造的食物来源，可以安装附近的蜂巢和动物可以收集。回到蜂房花粉觅食，可以识别 20后腿的花粉筐。
- 修复和处理：应避免冰蜜蜂延长冷却，因为它可能会影响他们的学习能力和生存，直到实验结束。跗管内仔细加以固定，以避免意外刺激蔗糖溶液。这是很重要的，因为蜜蜂已经证明，学习与succrose 解决方案3,21跗刺激。
- 嗅觉空调：空调试验的数量可以是多种多样的，审间的间隔，测试时间点取决于重点研究3,22。
- 喂养：蜜蜂的饱食水平是影响他们的学习表现和记忆保持 3,23 。这已规划的实验时，要考虑到。
- 注射液：气囊是在位于蜜蜂胸部17。呼吸道系统的这些重要的部分是为生存所必需的。因此应注意不要损坏气囊注射过程中的。释放的气泡表明气囊损坏。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是支持由德国联邦教育和研究部（BMBF）在伯恩斯坦焦点授予：学习（BFNL）DE神经元的基础，我们感谢门泽尔的手稿的早期版本上的宝贵意见Randolf。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syringe Omnifix 20 ml | B. Braun Medical | 4616200 V | |
| White refined household sugar | Kaisers Supermarket, Berlin, Germany | ||
| Clove oil | Bombastus, Freital, Germany | ||
| Multipette plus | Eppendorf | 4981 000.019 | |
| Rack for 30 bee tubes | Home made | ||
| Plastic tubes | Home made | ||
| UV light-permeable plexiglass pyramid | Home made | height = 30cm,apex 3.5 x 3.5cm,base 18x18cm | |
| Sticky tape | Tesa, Hamburg, Germany | ||
| Capillator sticks 1-5μl | Selzer | ||
| Capillator tips 1-5μl | Selzer | ||
| Filter paper 0.16-0.2 mm thick | Macherey-Nagel | MN 616 or MN615 | Adjusted to circular pieces with a 1.3 cm diameter |
| Disposable hypodermic needle | B. Braun Medical | 4657683 | 0.45 mm diameter |
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