Summary
我々は、薬物の全身アプリケーションによってミツバチの食欲の嗅覚コンディショニングのパラダイム（セイヨウミツバチ）の行動薬理学のメソッドを実装する方法を示します。 、このメソッドでは、メカニズムの基礎となる学習や、シンプルで信頼性の高い方法で、記憶形成の調査を可能にします。
Abstract
ミツバチ（ セイヨウミツバチ ） がよく彼らのコミュニケーションと向きのスキルのためにと彼らの印象的な学習能力の1,2のための知られている。ミツバチのコロニーの生存は、食料源の利用に依存するため、飼料収穫機ミツバチは、変数の花のサイトだけでなく、その収益性を学び、記憶する。飼料収穫機ミツバチは簡単に自然な設定で訓練することができますどこに彼らが餌場での飼料とそのような臭いや色など、関連する信号を学ぶ。食欲の連合学習は、エアコン、個別に活かさミツバチ3,4のテングザルの拡張子の応答（PER）によって実験室で制御された条件下で研究することができる。この学習のパラダイムでは、シンプルかつ信頼性の高い方法5-12に学習や記憶の形成の根底にある神経細胞および分子メカニズムの研究が可能になります。行動薬理学的なアプローチは、分子メカニズムを研究するために使用されます。薬物は、学習と記憶形成の13から16までの間または後に特定の分子の機能を妨害するために全身的に注入されています。
ここでは、PERコンディショニングに活かさミツバチを訓練する方法と、ミツバチの飛翔筋に全身に注入することにより薬物を適用する方法を示します。
Protocol
1。ハイブからキャッチ蜂
- 実験は、午後2〜4を開始する前に、ある日、ハイブを残してミツバチがキャッチされています。そのためには、頂点および基部で開閉可能なUV光透過性のプレキシガラスのピラミッドは、（高さ= 30センチ、頂点3,5 × 3、5 cmのベース18 × 18センチ）、、20で開催される - ベースのオープンと頂点を持つハイブの入り口の前に30cmの距離は、ハイブを残してミツバチがピラミッドの底辺を入力するように閉鎖。ベースはその後閉鎖され、キャプチャされたミツバチは、さらなる処理のための研究室に持ち込まれている。
2。ガラスバイアルにピラミッドから蜂を転送
- ラボでは、ピラミッドはそのベースに配置されます。ピラミッドの壁面は暗くなります（タオルなど）はしかし、頂点が発見されたままになります。開いたときのため、その正の走光性を、ミツバチが頂点を通じてピラミッドを残す。一つ一つは、ミツバチがオープン頂点上のバイアルを保持することによって、ガラスバイアルにピラミッドから転送されます。 1バイアルは、蜂ごとに使用されます。したがって、頂点は1つのミツバチは、バイアルに入ったときに閉じられます。
3。チューブの活用の蜂
- ミツバチは、2.5から3.5分間氷上でガラスバイアルに、それらを冷却することによって固定化される。蜂を見るとすぐそれが変化しないように氷からそれを削除することをお勧めします。
- 単一の固定されたミツバチは、それが自由ではなく、その頭部、胸部や脚の長い鼻を移動することになるように粘着テープ付きの小さなプラスチック製のチューブ、で活かされている。首が圧縮されていないことが重要です。
- プラスチックチューブで修正すべての蜂がより良いハンドリングと識別するためのラックの番号のボーリング孔に配置されます。それはコンディショニングまたはメモリ取得のために削除された後にチューブを常に正確に同じ孔に返されます。
4。餌蜂
- 最初の晩（4-6時）に、キャッチされた後、蜂はショ糖溶液（0,88 M、水道水に溶解した白洗練された家庭用砂糖）で満腹に供給されています。蜂を養うために、そのPERは、ショ糖溶液と動物とのアンテナがショ糖溶液の一滴（4μL）を消費するために許可されて触れることで誘発される。自分のアンテナがショ糖溶液で触れているとき、彼らはもはやPER高速かつ信頼性を示さないまで、ミツバチは、繰り返し次々に供給されています。
- 実験の蜂の後続の各夜（4-6時）にショ糖溶液の1滴（4μL、0,88 M、水道水で解決白い精製された砂糖）を使用して別の4倍々に供給されています。それは、ショ糖溶液を摂食中にミツバチのアンテナやテングザルに塗抹されていないことと、チューブがショ糖溶液で汚染されていないことが重要です。ミツバチは、ショ糖刺激によるトレーニングのコンテキストを関連付けるの可能性を排除するコンディショニングの部位またはその近くに供給されるべきではない。
5。活かした蜂が一晩に保つ
- ミツバチは、室温でプラスチック製のボウルで一晩保持されます。水道水は、ボウル（約0,5-1センチの高さ）に充填される。活かしたミツバチが付いているラックは、プラットフォームとしてのELISAプレートを使用して水線の上のボウルに配置されます。最後に、ボールは段ボールで覆われている。
6。嗅覚コンディショニング
実験の最初の朝（午前10時）に嗅覚調整が行われる。条件刺激（CS）が臭気である、無条件刺激（米国）は、ショ糖溶液です。
- 臭気（例えばクローブオイル）の4μLを20 mLシリンジに挿入される円形の濾紙（1,3 cmの直径）にピペットで。臭気は、ボンネットの下ピペットされ、フィルタのヒントは、ピペットの汚染を防止するために使用されています。
- 活かしたミツバチとラックは、コンディショニングの手順を開始する前にコンディショニングのサイトで30分の近くに配置し、しかし、単一のミツバチが調整されている排気管の前にある場所までの距離にあります。
- エアコンは10分の期日間間隔（ITI）を持つ3つの香りの組み合わせ（条件刺激、CS）とショ糖溶液（無条件刺激、米国、1,25 M）で構成されています。オーディオプレーヤーを介して実験者に配信される音響信号は、刺激開始、刺激オフセット、刺激の持続時間と配置の正確なタイミングが保証されます。買収の裁判は、排気の前で動物の10秒の位置から始まります。間もなく10秒の終わりの前に臭いを含む注射器は、ミツバチのアンテナを対象としたハチの目の前に3センチに配置されます。続いて、匂いは注射器を介して20mLの空気を押すことで、5秒間表示されます。最初の3秒後に両方のアンテナの遠位鞭毛は、つまようじと動物が4秒moistend爪楊枝をなめるために許可されているソリューションは、湿らせたショ糖で触れています。 13秒は、CSの刺激の終了後に、ミツバチは、トレーニングの文脈から取り出し、ラックに戻って配置されます。完全にグループレッスンの試験では、28秒間継続。
ハチの触角も長い鼻のどちらも調整後のショ糖で覆われていることが重要です。したがって、つまようじが唯一のスクロース溶液と爪楊枝でのショ糖溶液の形のない滴その湿らせていることを確保する必要があります。 - コンディショニング後にラックをボウルに戻って配置されます。
- 動物実験時の動作、配置とCSの間にPERの発生と米国のプレゼンテーションをすなわち、実験者によって監視され、下に記載されています。
7。記憶維持
- 保持テストは、任意の間隔（日数の分）で行うことができます。メモリテストが開始される前にミツバチを持つラックは、コンディショニングのサイトで30分の近くに配置されます。
- メモリテストは、米国のプレゼンテーションすることなく5秒CSのプレゼンテーションで構成されています。テストは、排気の前で動物の10秒の位置から始まります。前述のように続いて、臭いを5秒間表示されます。動物の行動は、配置時にPERの発生、すなわちとCSのプレゼンテーションは、実験中にダウンして注目される。
- 実験の終わりに口先延長の応答は、再び動物はまだその口吻を拡張できることを保証するためにショ糖溶液でアンテナに触れることで誘発される。
8。全身注射
全身注射の時点では、実験計画に依存します。
- 小さ な穴は、使い捨て注射針（21 G）を使用して、飛翔筋17は、上記のscutumの割れ目の横のたて座の後部のクチクラで作られています。
- ガラス毛細管を使用して、1μLのソリューションは、飛翔筋へのクチクラの穴から噴射される。訓練を受けた実験者は、注射やコンディショニングの正確なタイミングを可能にする、30秒ごとone蜂を注入することができます。
9。実験中に餌蜂
- コンディショニング後の夜（4-6時）に、ミツバチは、ショ糖溶液を1滴（4μL、0,88 M、水道水に溶解して白い精製された砂糖）を使用して別の4倍後のものを供給している。それは、ショ糖溶液を摂食中にミツバチのアンテナやテングザルに塗抹されていないことと、チューブがショ糖溶液で汚染されていないことが重要です。ミツバチは、ショ糖刺激によるトレーニングのコンテキストを関連付けるの可能性を排除するコンディショニングの部位またはその近くに供給されるべきではない。
10。データ収集とデータ解析
- 実験時の口先拡張応答の発生が監視されます。それは、CSの発症と米国のプレゼンテーション（研修中）の間またはCSのプレゼンテーション中に、その長い鼻を拡張する場合ハチが開いて顎の間に仮想回線を経由する、（テストフェーズで）正の得点が記録されます。
- 分析の動物に含まれるようにするには、2つの条件を満たす必要があります：彼らは、実験全体を生き残る必要で、それらは実験終了時にショ糖溶液に無条件口先拡張応答を（PER）を示す必要があります。獲得と保持テストの間にPERを示す蜂の割合は、各CSのプレゼンテーションのためにプロットされます。
11。代表的な結果：
二つの実験はここに表示されます。
最初の実験では、リン酸緩衝生理食塩水（PBSの全身注射の影響を見て、内のMM：137のNaCl、2,7のKCl、10,1のNa 2 HPO 4、1,8 KH 2 PO 4、pHが7、 2）学習と長期記憶の形成に。無処理群、トレーニング前に1μLPBSで30分間で注入した群、および治療を偽注射群：ミツバチの3つのグループは10分の期日間間隔で3 CS - USペアで訓練されたPBS注入群としてではなく、PBSを注入することなく、同じ方法で。トレーニングのメモリの24時間後は3つのグループすべてが1つのCSのプレゼンテーションでテストされています。コンディショニング時にエアコンの応答を示す動物の割合は、3つのトレーニングの試験にわたって大幅に増加する（図1、係数の時間を繰り返し測定するための分散分析F 2378 = 340456、P <0.05）。 PERの差は調整中に、三つのグループ（因子グループの繰り返し測定のための分散分析F2、189 = 1299、P> 0,05）との間で認められなかった。 PBS注入し、偽注射動物と非投与動物を比較するときに24時間の保持テスト（F2、187 = 0752、P> 0,05）の場合にも当てはまります。
タンパク質合成阻害剤のアニソマイシン（10 mm）を全身3つのC - USペアリング後に30分を注入したときに2番目の実験では、3、4日間のトレーニング後のメモリ保持の阻害を示す。 PBS注入群とアニソマイシン注入群の比較では、保持さtの間に群間で有意差を明らかにEST（図2、ファクターグループF1、94の繰り返し測定のANOVA = 8,86、P <0.05）。主な違いは、3日と4日目のメモリテストで観察することができます。これはWüstenberg らの結果に似ている。18また、別のプロトコルではあるが、三CS - US組み合わせで蜂を条件付け人。
図1。 PBSのクチクラの病変や注射は、買収と記憶の保持が変更されることはありません。動物は、3つのCS - USの組み合わせ（買収）で訓練された。 24時間後、メモリは（メモリ保持）試験された。トレーニング前の30分、穴が二つのグループのクチクラ（病変、PBS）で行われ、これらのグループの一つであった1μLPBS（PBS）を注入した。第三のグループは、（無処理）そのまま残されました。発表は各グループごとに臭気のプレゼンテーションに対応するための動物のパーセンテージです。 ANOVAは、アクイジションフェーズ（F2、189 = 1.299、P> 0.05）またはメモリ保持のグループ（F2、187 = 0.752、P> 0.05）の間に有意な違いは示されません。
図2。最後のCS - USのペアリング後にアニソマイシン40分の注入は、メモリの保持三日と四日間の訓練の後を削減。動物は、3つのCS - USの組み合わせ（買収）で訓練を受け、1μLの10mMアニソマイシン（異方性）または1μLのPBSを注入した最初のトレーニング試験1時間後。メモリは後72時間および96時間、（記憶保持）24時間、48時間をテストした。 PERと臭気のプレゼンテーションへの応答をグループごとに動物の割合は、され提示。アニソマイシンの注射は、ANOVAによって明らかにトレーニング（F1、94 = 8.86、p <0.05）が後の記憶保持72時間と96時間の大幅な削減につながります。
Discussion
- 蜂キャッチ：経験豊富な採餌蜂を収集するには、ミツバチは、ハチの子は向きのフライト19日にある時間を避けて、午前中か午後のいずれかで捕捉されます。飼料収穫機は花粉や蜜のいずれかを収集する。花粉と蜜の飼料収穫機の違いは、それらの糖応答性とその学習能力20によれば観察されている。唯一の蜜の飼料収穫機をキャッチするために、ショ糖溶液で満たされた人工的な食料源は、ハイブと動物の近くに設置することができますそこに収集することができる。ハイブに戻っ花粉飼料収穫機は、その後ろ足20日に花粉籠によって識別することができます。
- 修正と処理：それは実験の最後まで学習すると生存能力に影響を与える可能性があるため、氷上で蜂の拡張冷却は避けてください。足根は、ショ糖溶液による偶発的な刺激を避けるために、チューブ内に慎重に固定する必要があります。ミツバチがsuccroseソリューション3,21と足根刺激によって習得することが示されているので、これは、重要です。
- 嗅覚コンディショニング：コンディショニングの試行回数、期日間の間隔、およびテスト時間のポイントは、研究3,22の焦点に応じて変化させることができる。
- 餌：ミツバチの飽食のレベルは、その学習性能とメモリの保持3,23に影響を与えることが知られている。これは、実験を計画する際に考慮する必要があります。
- 注入：空気嚢は、ミツバチの胸部17に配置されています。呼吸器系のこれらの重要な部分は、生存のために必要です。したがって、注意を注入中に空気嚢を傷つけないように注意してください。気泡の放出は、空気嚢への損傷を示している。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
私たちは、原稿の以前のバージョン上で貴重なコメントをランドルフメンツェルに感謝学習の神経基盤（BFNL）DEへ：この作品は、バーンスタインフォーカス内教育研究省（BMBF）のドイツ連邦環境省からの助成金によって支えられて。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syringe Omnifix 20 ml | B. Braun Medical | 4616200 V | |
| White refined household sugar | Kaisers Supermarket, Berlin, Germany | ||
| Clove oil | Bombastus, Freital, Germany | ||
| Multipette plus | Eppendorf | 4981 000.019 | |
| Rack for 30 bee tubes | Home made | ||
| Plastic tubes | Home made | ||
| UV light-permeable plexiglass pyramid | Home made | height = 30cm,apex 3.5 x 3.5cm,base 18x18cm | |
| Sticky tape | Tesa, Hamburg, Germany | ||
| Capillator sticks 1-5μl | Selzer | ||
| Capillator tips 1-5μl | Selzer | ||
| Filter paper 0.16-0.2 mm thick | Macherey-Nagel | MN 616 or MN615 | Adjusted to circular pieces with a 1.3 cm diameter |
| Disposable hypodermic needle | B. Braun Medical | 4657683 | 0.45 mm diameter |
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