Summary
De Colon ascendens Stent Peritonitis (CASP) is een zeer gestandaardiseerd model voor de polymicrobiale abdominale sepsis bij knaagdieren. Dit artikel beschrijft de chirurgische ingreep van CASP. Het CASP model en zijn varianten kan de systematisch onderzoek van verschillende problemen met betrekking tot het onderwerp van sepsis.
Abstract
Sepsis blijft een hardnekkig probleem op de intensive care units over de hele wereld. Inzicht in de complexe mechanismen van sepsis is de voorwaarde voor de oprichting van nieuwe therapeutische benaderingen op dit gebied. Daarom zijn dierlijke modellen nodig die in staat zijn om nauw samen te bootsen de menselijke ziekte en ook voldoende omgaan met wetenschappelijke vragen. De Colon ascendens Stent Peritonitis (CASP) is een zeer gestandaardiseerd model voor de polymicrobiale abdominale sepsis bij knaagdieren. In dit model wordt een klein stent operatief ingebracht in de opgaande dikke darm van muizen of ratten leidt tot een continue lekkage van darmbacteriën in de buikholte. De procedure leidt tot peritonitis, systemische bacteriëmie, orgel infectie door darmbacteriën, en systemische maar ook lokale vrijlating van een aantal pro-en anti-inflammatoire cytokines. De dodelijkheid van CASP kan worden gecontroleerd door de diameter van de stent ingebracht. Een variant van dit model, de zogenaamde CASP met interventie (Caspi), verhoogt kans om de septische zich te verwijderen door een tweede operatie op basis van gemeenschappelijke procedures in de klinische praktijk. CASP is een makkelijk leerbaar en zeer reproduceerbaar model, dat nauw bootst het klinisch beloop van abdominale sepsis. Het leidt manier om te studeren op de vragen in verschillende wetenschappelijke domeinen zoals immunologie, infectiologie, of een operatie.
Protocol
1. Voorbereiding van de muis
- Verdoven van de muis door intraperitoneale injectie van de verdovende vloeistof (zie tabel van de reagentia) en plaats deze in rugligging.
- De voeten van de muis moeten worden bevestigd met tape op de plaat naar een stabiele positie van het dier tijdens de operatie te verzekeren.
2. Werking
- Neem een iv canule, die gewoonlijk is voor iv injectie wordt gebruikt bij mensen, en snijden de plastic buis circulair 2 mm van de punt. We maken gebruik van drie verschillende maten van canules aan de sterfte (BD Venflon 18GA (1,2 x45mm, 80 ml / min); 16GA (1,7 x45mm, 180 ml / min) 14GA (2,0 x45mm, 270 ml / min)) controle.
- Na een grondige desinfectie van de buikhuid, incise hij langs de middellijn over 15mm. Open de peritoneale grot door incisie de buikspieren en het buikvlies langs de linea alba.
- Identificeer de cecal paal en voorzichtig trek blindedarm, terminale ileum en colon ascendens uit de buik door het gebruik van wattenstaafjes.
- 15 mm distaal van de Bauhin klep, moet men doorboren de wand van het colon ascendens met een 7 / 0 hechtdraad. Daarbij, beschadiging van de darm schepen moeten worden vermeden. De hechting is gefixeerd op de colon muur door twee chirurgische knopen.
- Nu prik het colon ascendens met de voorbereide canule 1-2 mm proximaal van de 7 / 0 hechtdraad. Schuif de canule in de dikke darm tot aan de groef in de plastic buis ter hoogte van de serosa.
- Zet de vrije uiteinden van de 7 / 0 hechtdraad rond de canule en plaats een twee-voudige knoop precies in de voorbereide groef van de kunststof buis.
- Neem nu de naald van de 7 / 0 hechtdraad en steek het door de antimesenteric wand van de dikke darm. Achtereenvolgens twee chirurgische knopen moeten worden uitgevoerd om de plastic buisje bovendien vast te stellen in het colon muur. Snijd de hechting eindigt.
- Haal de ijzeren gedeelte van de canule een beetje en snijd de plastic buis af te sluiten (1 mm) op de vaststelling 7 / 0 hechtdraad.
- Nu moet men zorgvuldig ontlasting melk uit de blindedarm de richting van de dikke darm stent door het gebruik van wattenstaafjes tot een klein puntje van ontlasting verschijnt op de top van de stent.
- Leg de darm in de peritoneale grot en performe vochttoediening door intraperitoneale toediening van 0,5 ml zoutoplossing.
- Sluit het buikvlies met doorlopende hechting (4 / 0).
- Sluit de huid met hechtingen enkelvoud (4 / 0).
3. Postoperatieve zorg
- Zet het dier terug in zijn kooi, die voldoende voedsel en water moet bevatten. Voor analgesie, dient intraperitoneale toediening van een krachtige pijnstillende stof (we gebruiken buprenorfine) regelmatig worden uitgevoerd.
- Binnen de eerste twee dagen na de operatie, moet men de controle van de dieren om de 6 uur.
4. Sham CASP
- Voer de stappen 1,1-2,4.
- Niet doorboren de dikke darm. Voer dan stappen 2,6-2,8.
- Voer de stappen 2.10-3.2.
5. Caspi
- Voer CASP met behulp van een canule 14G volgende stappen 1.1-3.1
- 5u na CASP, moet men het dier weer te bedienen. Voor te bereiden en opnieuw verdoven met de muis hand van de stappen 1.1-1.2
- Open de hechtingen van de buikwand.
- Trek het colon ascendens met ingelegde de stent.
- Knip voorzichtig de hechtingen tot vaststelling van de stent en verwijder de stent.
- Sluit het defect in de dikke darm met een enkele keren hechtingen (7 / 0).
- Leg de darmen in de buikholte en twee keer spoelen de laatste met 10 ml zoutoplossing.
- Sluit het buikvlies met doorlopende hechting (4 / 0).
- Sluit de huid met hechtingen enkelvoud (4 / 0).
- Volg de stappen 3,1-3,2
6. Representatieve resultaten
Binnen een paar uur na de operatie, de dieren klinische symptomen vertonen van een beginnende sepsis. Typische symptomen van de ziekte zijn mobiliteit, driegend jas verminderd, zweten, verminderde voedselinname, gewichtsverlies en verminderde ook uitje gedrag. Dieren ontwikkelen van een ernstige peritonitis met opeenvolgende systemische infectie meestal sterven binnen 48u. Afhankelijk van de geplaatste stent formaat, kan verschillende sterftecijfers worden gegenereerd. Een 14G stent resulteert in 100% mortaliteit, 16G geeft 70% sterfte en sterfte van 50% kan worden bereikt door middel van een 18G stent (figuur 1a). De Sham operatie resulteert in een overlevingspercentage van 100%. Meestal sterven alle dieren daartussen de eerste 48 uur na CASP. Zo kunnen alle dieren die leven op dit tijdstip worden beschouwd als overlevenden. Echter, we raden een extra observatieperiode van ten minste 72 uur voor zeldzame "late doden" na CASP te detecteren.
De uitkomst van Caspi hangt af van de termijn na CASP wanneer de stent wordt verwijderd. Een interventie 3 uur na CASP resulteert in een overlevingspercentage van 45%. Als de stent is 5h verwijderd na CASP, slechts 10% vande dieren overleven de procedure. Een stent verwijderd na 9 uur resulteert in een mortaliteit van 100% (Figuur 1b). Sham Caspi leidt tot 100% overleving. Voor Caspi instellingen, adviseren wij een observatieperiode van 10 dagen, omdat er meestal dieren, die sterft later dan 48 uur na CASP.
Macroscopische inspectie van de buik situs 24 uur na CASP laat de typische tekenen van peritonitis: oedeem, vasodilatatie, erythema darmwand, scherpe afbakening van de plaques van Peyer, darm verlamming, vrij vocht, en septische secretie (figuur 2).
De systemische infectie kan worden aangetoond door bacteriologische analyse. 12 uur na CASP, enorme hoeveelheden bacteriën kan worden gedetecteerd in peritoneale lavage, bloed, lever, longen, milt en nieren. Kwalitatieve analyse van bacteriën onthult systemische infectie door de typische darmbacteriën zoals E. coli, Bacteroides species, Enterococcus species, enz. (figuur 3).
CASP-geïnduceerde sepsis manifesteert in de lokale en systemische afgifte van pro-en anti-inflammatoire cytokines en chemokines. 12 uur na CASP, significante hoeveelheden TNF, IL-1β, IL-6, IL-10, MCP-1 en anderen kan worden gemeten met behulp van ELISA in het bloed, maar ook in supernatanten van organen suspensies, zoals lever, longen, milt, nieren (afb. 4).
Bij het vaststellen van CASP in uw laboratorium, overleving, bacteriologie en cytokine release moeten worden genomen als controle parameters voor een correcte uitvoering van CASP. Later kunnen deze parameters worden genomen als standaard read out-systeem voor alle experimentele instellingen.
Figuur 1a: Survival na CASP. Overleving na een operatie CASP afhankelijk van de diameter van de geplaatste stent. 14G CASP resulteert in een sterftecijfer van 100%, 16G CASP resulteert in een 70% sterfte, en 18G CASP leidt tot 50% sterfte. Sham CASP wordt geassocieerd met een overleving van 100%. . n = 20/group B: Survival tarieven na Caspi een operatie afhankelijk van het tijdstip van de stent te verwijderen. Stent verwijdering op 3 uur na 14G CASP leidt tot een sterftecijfer van 55%. Stent verwijderen om 5u na 14G CASP resulteert in een mortaliteit van 90%, terwijl de stent verwijderd om 9u na 14G CASP resulteert in 100% sterfte. Sham Caspi (5u) resulteert in een overleving van 100%. n = 10/group (Sham Caspi, Caspi 9u), n = 20/group (3u Caspi, 5u Caspi).
Figuur 2: Abdominale situs 24 uur na CASP. De buikwand werd verwijderd 24 uur na 16G CASP of sham CASP, respectievelijk. De situs van de sham bediend muis ziet er fysiologische. In tegenstelling, CASP resulteert in oedeem, hyperemie, gedilateerd darmen, en de afbakening van plaques van Peyer demonstreren ernstige buikvliesontsteking.
Figuur 3: Bacteriologie. CASP leidt tot een ernstige infectie van verschillende compartimenten en organen door darmbacteriën binnen 12 uur na de operatie. Bacteriële getallen worden gegeven als kolonievormende eenheden (kve) per ml. Bacterieculturen genomen van sham bediend muizen zijn volledig steriel (niet getoond). 16G CASP, n = 5/group.
Figuur 4: cytokinen. CASP triggers een systemische immuunreactie als verschillende cytokines en chemokines zijn detecteerbaar in plasma en ook in organen supernatants. De figuur laat als voorbeeld van de pro-inflammatoire cytokines tumor necrose factor (TNF) en interleukine-6 (IL-6) en de overwegend anti-inflammatoire IL-10. 12h na CASP, kan opmerkelijke niveau worden gedetecteerd in plasma, lever, longen en milt. Echter, IL-10 niet worden gedetecteerd in de longen en de milt na CASP. Sham operatie leidt niet tot een cytokine secretie (niet getoond). 16G CASP, n = 5/group.
Discussion
CASP is een polymicrobiale model van abdominale sepsis dat de meeste criteria gepostuleerd voor een waardevolle sepsis model voldoet: CASP kan worden uitgevoerd in kleine dieren, is zeer reproduceerbaar, gemakkelijk te controleren door middel van standaard parameters, biedt een goede uitgelezen mogelijkheden, en nauw bootst klinische instellingen van abdominale sepsis. In een vergelijkende studie konden we aantonen dat CASP leidt tot peritonitis diffuse met vroege en gestaag toenemende systemische infecties en ontstekingen (systemic inflammatory response syndrome), terwijl cecal ligatie en prik (CLP) toont een model van de intra-abdominaal abces formatie met duurzame en kleine symptomen van systemische ontsteking (1). De techniek van Caspi biedt een mogelijkheid om het klinische verloop van peritonitis simuleren met opeenvolgende chirurgische richten sanitaire voorzieningen, dat is het belangrijkste therapeutische principe bij de mens. CASP kan worden toegepast voor alle vragen rondom sepsis of peritonitis en is daarom geschikt voor alle disciplines omgaan met sepsis onderzoek, bijvoorbeeld immunologie, farmacologie, chirurgie, intensive care geneeskunde, etc. Een selectie van publicaties over verschillende onderwerpen van sepsis het gebruik van de CASP model wordt hieronder gegeven (1-14).
Bij het starten met CASP, dient men zich ervan bewust dat wat oefening nodig is om de operatie uit te voeren precies en snel. Chirurgische ervaring kan nuttig zijn, maar is niet vereist. Wij raden detectie van letality als een parameter voor de juiste uitvoering van CASP. Men moet beginnen met 14G CASP als een groot stent is gemakkelijker te hanteren dan een dunnere een. Een getrainde CASP chirurg in staat is om een muis te bedienen binnen de 10 minuten. Voordat u begint met experimenten, moet u ervoor zorgen dat u zich in de buurt die periode. Als u enige ervaring met de chirurgische procedure opgedaan, moet u voert een survival kinetische om je vaardigheden te controleren. 14G CASP zou moeten resulteren in een 100% letaliteit. Beginners in ons laboratorium hebben om te bewijzen dat ze in staat zijn om een 100% letaliteit met 14G CASP genereren voordat ze beginnen met experimenten. Bovendien, bacteriologie en cytokine metingen moeten worden uitgevoerd om sepsis te controleren. Als u problemen hebt in het begin met de microchirurgische stappen van CASP, kan het gebruik van een vergrootglas of een chirurgische microscoop nuttig zijn. Maar in principe kan CASP goed worden uitgevoerd zonder deze hulpprogramma's. Voor de reproductie van onze overleving, is het absoluut noodzakelijk dat dezelfde materialen, met name de stents (BD Venflon, zie hieronder), worden gebruikt. Anders, aanzienlijke verschillen van de resultaten zijn mogelijk. Daarnaast stellen we voor dat er kan worden variaties van de resultaten, afhankelijk van, bijvoorbeeld, de eigenheid van de chirurg. Toch moet de invloed van factoren zoals die te klein zijn.
Samengevat, CASP is een praktisch, eenvoudig, reproduceerbare en waardevolle sepsis model dat nauw bootst de klinische situatie van abdominale sepsis. Het is daarom geschikt voor alle terreinen van sepsis onderzoek.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs danken Nico Zantl, Klaus Pfeffer, en Bernhard Holzmann. Dit onderzoek werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft, Bonn-Bad Godesberg, Duitsland (GRK-840; Vo 450/10-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Narcotic fluid | Mix 0.5 mL Rompun with 4.0 mL Ketanest, and add 5.5 mL of saline solution (0.9%).For complete anesthesia, inject intraperitoneally 10 μL/g body weight | ||
| Rompun (20 mg/ml Xylazine) | Bayer AG | ||
| Ketanest (25mg/ml Esketamine) | Pfizer Pharma GmbH | 647028001E | |
| BD Venflon 18GA (1,2x45mm, 80ml/min) | BD Biosciences | 391457 | |
| BD Venflon 16GA (1,7x45mm, 180ml/min) | BD Biosciences | 391455 | |
| BD Venflon 14GA (2,0x45mm, 270ml/min) | BD Biosciences | 391456 | |
| Catgut Polyester 4/0 white, non absorbable | Catgut GmbH | 17218113 | |
| Mariderm black 7/0, non absorbable | Catgut GmbH | 18104900 |
References
- Maier, S., Traeger, T., Entleutner, M., Westerholt, A., Kleist, B., Huser, N., Holzmann, B., Stier, A., Pfeffer, K., Heidecke, C. D. Cecal ligation and puncture versus colon ascendens stent peritonitis: two distinct animal models for polymicrobial sepsis. Shock. 21, 505-511 (2004).
- Bougaki, M., Searles, R. J., Kida, K., Yu, J. D. e, Buys, E. S., Ichinose, F. NOS3 protects against systemic inflammation and myocardial dysfunction in murine polymicrobial sepsis. Shock. , (2009).
- Buras, J. A., Holzmann, B., Sitkovsky, M. Animal models of sepsis: setting the stage. Nat Rev Drug Discov. 4, 854-865 (2005).
- Busse, M., Traeger, T., Potschke, C., Billing, A., Dummer, A., Friebe, E., Kiank, C., Grunwald, U., Jack, R. S., Schutt, C., Heidecke, C. D., Maier, S., Broker, B. M. Detrimental role for CD4+ T lymphocytes in murine diffuse peritonitis due to inhibition of local bacterial elimination. Gut. 57, 188-195 (2008).
- Daubeuf, B., Mathison, J., Spiller, S., Hugues, S., Herren, S., Ferlin, W., Kosco-Vilbois, M., Wagner, H., Kirschning, C. J., Ulevitch, R., Elson, G. TLR4/MD-2 monoclonal antibody therapy affords protection in experimental models of septic shock. J Immunol. 179, 6107-6114 (2007).
- Entleutner, M., Traeger, T., Westerholt, A., Holzmann, B., Stier, A., Pfeffer, K., Maier, S., Heidecke, C. D. Impact of interleukin-12, oxidative burst, and iNOS on the survival of murine fecal peritonitis. Int J Colorectal Dis. 21, 64-70 (2006).
- Kerschen, E. J., Fernandez, J. A., Cooley, B. C., Yang, X. V., Sood, R., Mosnier, L. O., Castellino, F. J., Mackman, N., Griffin, J. H., Weiler, H. Endotoxemia and sepsis mortality reduction by non-anticoagulant activated protein. C. J Exp Med. 204, 2439-2448 (2007).
- Kiank, C., Koerner, P., Kessler, W., Traeger, T., Maier, S., Heidecke, C. D., Schuett, C. Seasonal variations in inflammatory responses to sepsis and stress in mice. Crit Care Med. 35, 2352-2358 (2007).
- Lustig, M. K., Bac, V. H., Pavlovic, D., Maier, S., Grundling, M., Grisk, O., Wendt, M., Heidecke, C. D., Lehmann, C. Colon ascendens stent peritonitis--a model of sepsis adopted to the rat: physiological, microcirculatory and laboratory changes. Shock. 28, 59-64 (2007).
- Traeger, T., Kessler, W., Assfalg, V., Cziupka, K., Koerner, P., Dassow, C., Breitbach, K., Mikulcak, M., Steinmetz, I., Pfeffer, K., Heidecke, C. D., Maier, S. Detrimental role of CC chemokine receptor 4 in murine polymicrobial sepsis. Infect Immun. 76, 5285-5293 (2008).
- Traeger, T., Kessler, W., Hilpert, A., Mikulcak, M., Entleutner, M., Koerner, P., Westerholt, A., Cziupka, K., Rooijen, N. van, Heidecke, C. D., Maier, S. Selective depletion of alveolar macrophages in polymicrobial sepsis increases lung injury, bacterial load and mortality but does not affect cytokine release. Respiration. 77, 203-213 (2009).
- Traeger, T., Mikulcak, M., Eipel, C., Abshagen, K., Diedrich, S., Heidecke, C. D., Maier, S., Vollmar, B. Kupffer cell depletion reduces hepatic inflammation and apoptosis but decreases survival in abdominal sepsis. Eur J Gastroenterol Hepatol. , (2010).
- Weighardt, H., Kaiser-Moore, S., Schlautkotter, S., Rossmann-Bloeck, T., Schleicher, U., Bogdan, C., Holzmann, B. Type I IFN modulates host defense and late hyperinflammation in septic peritonitis. J Immunol. 177, 5623-5630 (2006).
- Zantl, N., Uebe, A., Neumann, B., Wagner, H., Siewert, J. R., Holzmann, B., Heidecke, C. D., Pfeffer, K. Essential role of gamma interferon in survival of colon ascendens stent peritonitis, a novel murine model of abdominal sepsis. Infect Immun. 66, 2300-2309 (1998).
