Summary
Das Colon ascendens Stent Peritonitis (CASP) ist ein hoch standardisiertes Modell für polymikrobiellen abdominalen Sepsis bei Nagetieren. Dieser Artikel beschreibt das chirurgische Verfahren der CASP. Die CASP Modell und seine Varianten ermöglichen die systematische Untersuchung verschiedener Probleme rund um das Thema Sepsis.
Abstract
Sepsis bleibt ein hartnäckiges Problem auf Intensivstationen in der ganzen Welt. Das Verständnis der komplexen Mechanismen der Sepsis ist die Voraussetzung für die Etablierung neuer therapeutischer Ansätze in diesem Bereich. Daher sind Tiermodelle erforderlich, dass in der Lage, genau imitieren die menschliche Krankheit und auch ausreichend mit wissenschaftlichen Fragen befassen werden. Das Colon ascendens Stent Peritonitis (CASP) ist ein hoch standardisiertes Modell für polymikrobiellen abdominalen Sepsis bei Nagetieren. In diesem Modell wird eine kleine Stents chirurgisch in den aufsteigenden Dickdarm von Mäusen oder Ratten, die zu einer kontinuierlichen Austritt von Darmbakterien in die Bauchhöhle eingeführt. Das Verfahren führt zu Peritonitis, systemische Bakteriämie, Orgel Infektion durch Darmbakterien, und die systemische, sondern auch lokale Freisetzung von mehreren pro-und anti-inflammatorischen Zytokinen. Die Letalität der CASP kann durch den Durchmesser der eingelegten Stents gesteuert werden. Eine Variante dieses Modells, das sogenannte CASP mit Intervention (Caspi) wirft Gelegenheit, den septischen Fokus durch eine zweite Operation nach üblichen Verfahren in der klinischen Praxis zu entfernen. CASP ist eine leicht erlernbare und hoch reproduzierbare Modell, imitiert den klinischen Verlauf der abdominalen Sepsis. Es führt so zu Fragen in mehreren wissenschaftlichen Disziplinen wie zB Immunologie, Infektiologie, oder eine Operation zu studieren.
Protocol
1. Vorbereitung der Maus
- Anesthetize der Maus durch intraperitoneale Injektion des Betäubungsmittels Flüssigkeit (siehe Tabelle der Reagenzien) und platziere sie in Rückenlage.
- Die Füße der Maus müssen mit Klebeband auf der Platte befestigt werden, um eine stabile Position des Tieres während der Operation zu gewährleisten.
2. Betrieb
- Nehmen Sie eine iv Kanüle, die üblicherweise für iv Injektionen bei Menschen verwendet, und schnitzen ihre Kunststoffrohr zirkular 2mm von der Spitze. Wir verwenden drei verschiedene Größen von Kanülen, die Sterblichkeitsraten (BD Venflon 18GA (1,2 x45mm, 80 mL / min); 16GA (1,7 x45mm, 180 mL / min) 14GA (2,0 x45mm, 270 mL / min)) zu kontrollieren.
- Nach gründlicher Desinfektion der Bauchhaut, incise es entlang der Mittellinie ca. 15mm. Öffnen Sie die peritoneale Höhle durch Einschneiden der Bauchmuskeln und dem Bauchfell entlang der Linea alba.
- Identifizieren Sie die Zökalpol und ziehen Sie vorsichtig Blinddarm, terminalen Ileum und Colon ascendens aus dem Bauch durch die Verwendung von Wattestäbchen.
- 15mm distal von der Ileozökalklappe, hat man zu durchdringen die Wand des Colon ascendens mit einer 7 / 0 Nahtmaterial. Dabei haben Läsionen des Darms Schiffe zu vermeiden. Die Naht ist auf der Kolon-Wand durch zwei chirurgische Knoten befestigt.
- Jetzt Punktion des Colon ascendens mit dem vorbereiteten Kanüle 1-2 mm proximal vom 7 / 0 Nahtmaterial. Schieben Sie die Kanüle in den Dickdarm bis die Furche in das Kunststoffrohr befindet sich auf einem Niveau mit der Serosa.
- Legen Sie die freien Enden der 7 / 0 Nahtmaterial um die Kanüle und Ort einer zweifachen Knoten genau in die vorbereiteten Furche der Kunststoffrohr.
- Nun nehmen Sie die Nadel des 7 / 0 Nahtmaterial und nähen sie durch die antimesenteriale Wand des Dickdarms. Nacheinander wurden zwei chirurgische Knoten ausgeführt werden, um zusätzlich fixieren das Kunststoffrohr in den Kolonwand werden. Schneiden Sie die Fadenenden.
- Rufen Sie die Eisen Teil der Kanüle ein wenig und schneiden das Kunststoffrohr aus der Nähe (1mm) die Festsetzung 7 / 0 Nahtmaterial.
- Nun muss man vorsichtig Milch Stuhl aus dem Blinddarm in Richtung des Dickdarms Stent durch den Einsatz von Wattestäbchen, bis ein kleines Trinkgeld von Stuhl erscheint oben auf dem Stent.
- Setzen Sie den Darm wieder in den peritonealen Höhle und performe Flüssigkeitszufuhr durch intraperitoneale Gabe von 0,5 ml Kochsalzlösung.
- Schließen Sie das Bauchfell mit fortlaufenden Naht (4 / 0).
- Schließen Sie die Haut mit singulären Nähten (4 / 0).
3. Postoperative Pflege
- Setzen Sie das Tier zurück in seinen Käfig, der genügend Nahrung und Wasser enthalten sollte. Für Analgesie sollte intraperitoneale Verabreichung eines starken analgetischen Substanz (wir verwenden Buprenorphin) regelmäßig durchgeführt werden.
- Innerhalb der ersten zwei Tage nach der Operation, hat man die Kontrolle der Tiere alle 6 Stunden.
4. Sham CASP
- Führen Sie die Schritte 1,1-2,4.
- Nicht durchlöchern den Dickdarm. Nur die Schritte 2,6-2,8.
- Führen Sie die Schritte 2,10-3,2.
5. Caspi
- Führen CASP mit einer 14G Kanüle folgenden Schritte 1,1-3,1
- 5h nach CASP, muss man das Tier wieder in Betrieb. Vorbereiten und betäuben die Maus wieder nach den Schritten von 1,1 bis 1,2
- Öffnen Sie die Nähte der Bauchwand.
- Ziehen Sie das Colon ascendens mit dem Stent eingesetzt.
- Schneiden Sie vorsichtig die Fäden Fixierung des Stents und entfernen Sie den Stent.
- Schließen Sie die Fehler in den Dickdarm mit Einzel-invertierenden Einzelknopfnähten (7 / 0).
- Setzen Sie den Darm wieder in die Bauchhöhle und bündig diese zweimal mit 10 ml Kochsalzlösung.
- Schließen Sie das Bauchfell mit fortlaufenden Naht (4 / 0).
- Schließen Sie die Haut mit singulären Nähten (4 / 0).
- Folgen Sie den Schritten von 3,1 bis 3,2
6. Repräsentative Ergebnisse
Innerhalb weniger Stunden nach der Operation, zeigen Tiere klinische Zeichen einer beginnenden Sepsis. Typische Symptome der Krankheit Mobilität, horrent Mantel reduziert, Schwitzen, verminderte Nahrungsaufnahme, Gewichtsverlust und reduzierte auch Wochenende Verhalten. Tiere entwickeln eine schwere Peritonitis mit konsekutiver systemische Infektion in der Regel innerhalb von 48 Stunden sterben. Abhängigkeit von der eingelegten Stents Größe können unterschiedliche Sterblichkeitsraten erzeugt werden. A 14G Stent Ergebnisse in 100% Mortalität, gibt 16G 70% Mortalität und Mortalität von 50% kann durch Verwendung eines 18G-Stent (Abbildung 1a) erreicht werden. Die Sham-Betrieb ergibt sich eine Überlebensrate von 100%. Normalerweise sterben alle Tiere der ersten 48 Stunden nach CASP dazwischen. So können alle Tiere, die lebend zu diesem Zeitpunkt sind als Überlebende betrachtet werden. Wir empfehlen jedoch, eine zusätzliche Beobachtungszeit von mindestens 72 Stunden zu selten "späten Todesfälle" nach CASP erkennen.
Das Ergebnis der Caspi ist abhängig von der Zeit nach CASP wenn der Stent entfernt wird. Eine Intervention 3h nach CASP ergibt sich eine Überlebensrate von 45%. Wenn der Stent 5h entfernt, nachdem CASP, nur 10% derDie Tiere überleben die Prozedur. Ein Stent Entfernung nach 9h ergibt sich eine Mortalität von 100% (Abb. 1b). Sham Caspi führt zu 100% ige Überlebensrate. Für Caspi Einstellungen, empfehlen wir einen Beobachtungszeitraum von 10 Tagen, weil es in der Regel Tiere, die später als 48 Stunden nach CASP sterben.
Makroskopische Untersuchung der abdominalen Situs 24 Stunden nach CASP zeigt typische Zeichen von Peritonitis: Ödem, Vasodilatation, erythematöser Darmwand, scharfe Abgrenzung der Peyer-Plaques, Darm Lähmung, freie Flüssigkeit und septischen Sekretion (Abbildung 2).
Die systemische Infektion kann durch bakteriologische Analyse gezeigt werden. 12 Stunden nach CASP, massive bakterielle Beträge können in Peritoneallavage erkannt werden, Blut, Leber, Lunge, Milz und Nieren. Qualitative Analyse von Bakterien zeigt eine systemische Infektion durch typische Darmbakterien wie E. coli, Bacteroides Spezies, Enterococcus species, etc. (Abbildung 3).
CASP-induzierten Sepsis manifestiert sich in lokalen und auch systemischen Freisetzung von pro-und anti-inflammatorische Zytokine und Chemokine. 12 Stunden nach CASP, erhebliche Mengen an TNF, IL-1β, IL-6, IL-10, MCP-1 und andere können durch ELISA im Blut, sondern auch in Überständen von Orgel Suspensionen, z. B. Leber, Lunge, Milz, Niere gemessen (Abb. 4).
Bei der Festlegung CASP in Ihrem Labor, Überlebensraten, Bakteriologie und Zytokinfreisetzung sollte als Regelparameter für die korrekte Durchführung der CASP genommen werden. Später können diese Parameter genommen als Standard ausgelesen System für alle experimentellen Einstellungen.
Abbildung 1a: Überleben nach CASP. Die Überlebensraten nach CASP Operation hängen vom Durchmesser der eingelegten Stents. 14G CASP Ergebnisse in einer Mortalitätsrate von 100%, 16G CASP Ergebnisse in 70% Mortalität und 18G CASP führt zu 50% Mortalität. Sham CASP ist mit einer Überlebensrate von 100% verbunden. . n = 20/group B: Überlebensraten nach Caspi Operation am Zeitpunkt der Stent-Entfernung ab. Stententfernung bei 3h nach 14G CASP führt zu einer Sterblichkeitsrate von 55%. Stententfernung um 5 Uhr nach 14G CASP Ergebnisse in einer Mortalitätsrate von 90%, während Stententfernung bei 9h nach 14G CASP Ergebnisse in 100% Mortalität. Sham Caspi (5h) ergibt sich eine Überlebensrate von 100%. n = 10/group (Sham Caspi, Caspi 9h), n = 20/group (3h Caspi, 5h Caspi).
Abbildung 2: Abdominal situs 24 Stunden nach CASP. Die Bauchdecke entfernt wurde 24 Stunden nach 16G CASP oder sham CASP jeweils. Der Situs der scheinoperierten Maus aussieht physiologischen. Im Gegensatz dazu zeigen CASP Ergebnisse in Ödeme, Hyperämie, dilatiert Darm und Abgrenzung der Peyer-Plaques schwere Bauchfellentzündung.
Abbildung 3: Bakteriologie. CASP führt zu schweren Infektion von mehreren Kompartimenten und Organen durch die Darmbakterien in 12h nach der Operation. Bakterielle Zahlen werden als Kolonie-bildende Einheiten (KBE) pro ml, bzw. gegeben. Bakterienkulturen aus scheinoperierten Mäusen entnommen sind völlig steril (nicht dargestellt). 16G CASP, n = 5/group.
Abbildung 4: Zytokine. CASP löst eine systemische Immunantwort wie mehrere Zytokine und Chemokine nachweisbar in Plasma und auch in Orgel Überstände. Die Abbildung zeigt beispielhaft die pro-inflammatorischen Zytokinen Tumor Nekrose Faktor (TNF) und Interleukin-6 (IL-6) sowie die vorwiegend anti-inflammatorische IL-10. 12h nach CASP können bemerkenswerten Spiegel im Plasma, Leber, Lunge und Milz nachgewiesen werden. Allerdings kann IL-10 nicht in Lunge und Milz nach CASP erkannt werden. Sham-Betrieb zu keiner Zytokinsekretion (nicht dargestellt) führen. 16G CASP, n = 5/group.
Discussion
CASP ist ein polymikrobiellen Modell der abdominalen Sepsis, dass die meisten Kriterien für eine wertvolle Sepsis-Modell postuliert erfüllt: CASP können in kleinen Tieren durchgeführt werden, ist in hohem Maße reproduzierbar, leicht durch Standard-Parameter zu überwachen, sorgt für gute Auslesen Möglichkeiten, und ahmt klinischen Einstellungen abdominalen Sepsis. In einer vergleichenden Studie konnten wir zeigen, dass CASP zu diffundieren mit der frühen und stetig wachsenden systemischen Infektion und Entzündung (systemische inflammatorische Response-Syndrom) Peritonitis führt, während cecal Ligatur und Punktion (CLP) zeigt ein Modell des intra-abdominale Abszesse mit nachhaltigem und Moll Anzeichen einer systemischen Entzündung (1). Die Technik des Caspi präsentiert eine Möglichkeit, den klinischen Verlauf der Peritonitis mit konsekutiver chirurgischer Schwerpunkt Abwasserentsorgung, die die wichtigste therapeutische Prinzip beim Menschen zu simulieren. CASP kann für alle Fragen rund um Sepsis oder Peritonitis angewendet werden und ist daher nützlich für alle Disziplinen, die sich mit Sepsis-Forschung, zum Beispiel Immunologie, Pharmakologie, Chirurgie, Intensivmedizin, etc. Eine Auswahl von Publikationen über verschiedene Themen der Sepsis mit dem CASP Modell unter (1-14) gegeben.
Beim Starten mit CASP, sollte man sich bewusst sein, dass einige der Praxis notwendig, um den Vorgang genau und schnell durchzuführen ist. Chirurgische Erfahrung kann hilfreich sein, ist aber nicht erforderlich. Wir empfehlen Erkennung von Letalität als Parameter für die korrekte Durchführung der CASP. Man sollte mit 14G CASP anfangs eine Stent ist einfacher zu handhaben als eine dünne. Ein ausgebildeter CASP Chirurg ist in der Lage, eine Maus innerhalb von 10 Minuten zu betreiben. Vor Beginn der Experimente, sollten Sie sicherstellen, dass Sie in der Nähe dieser Zeit sind. Wenn Sie einige Erfahrung mit dem chirurgischen Eingriff gewonnen, sollten Sie führen ein Überleben kinetische, um Ihre Fähigkeiten zu prüfen. 14G CASP sollte in eine 100% ige Letalität führt. Anfänger in unserem Labor haben zu beweisen, dass sie in der Lage, eine 100% ige Letalität mit 14G CASP erzeugen, bevor sie mit den Experimenten beginnen. Zusätzlich Bakteriologie und Zytokin-Messungen durchgeführt werden, um Sepsis zu überprüfen. Wenn Sie Probleme im Anfang bei der mikrochirurgischen Schritte CASP haben, kann der Einsatz von Lupen oder ein Operationsmikroskop hilfreich sein. Aber im Prinzip kann CASP auch ohne diese Programme ausgeführt werden. Für Reproduktion unserer Überlebensraten, ist es absolut notwendig, dass die gleichen Materialien, vor allem die Stents (BD Venflon, siehe unten), verwendet werden. Andernfalls sind erhebliche Schwankungen der Ergebnisse möglich. Darüber hinaus empfehlen wir, dass es Abweichungen von den Ergebnissen abhängig, zum Beispiel, die Individualität der Chirurg sein. Allerdings sollte der Einfluss von Faktoren wie klein sein.
Zusammenfassend ist CASP eine praktikable, einfache, reproduzierbare und wertvolle Sepsis Modell, das ahmt die klinische Situation der abdominalen Sepsis. Es eignet sich daher für alle Bereiche der Sepsis-Forschung.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren danken Nico Zantl, Klaus Pfeffer und Bernhard Holzmann. Diese Studie wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft, Bonn-Bad Godesberg, Deutschland (; Vo 450/10-1 GRK-840) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Narcotic fluid | Mix 0.5 mL Rompun with 4.0 mL Ketanest, and add 5.5 mL of saline solution (0.9%).For complete anesthesia, inject intraperitoneally 10 μL/g body weight | ||
| Rompun (20 mg/ml Xylazine) | Bayer AG | ||
| Ketanest (25mg/ml Esketamine) | Pfizer Pharma GmbH | 647028001E | |
| BD Venflon 18GA (1,2x45mm, 80ml/min) | BD Biosciences | 391457 | |
| BD Venflon 16GA (1,7x45mm, 180ml/min) | BD Biosciences | 391455 | |
| BD Venflon 14GA (2,0x45mm, 270ml/min) | BD Biosciences | 391456 | |
| Catgut Polyester 4/0 white, non absorbable | Catgut GmbH | 17218113 | |
| Mariderm black 7/0, non absorbable | Catgut GmbH | 18104900 |
References
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