Summary
Колон Ascendens Стент Перитонит (CASP) является весьма стандартизированной модели для полимикробная абдоминального сепсиса у грызунов. В этой статье описывается хирургическая процедура CASP. Модель CASP и его варианты позволяют систематическое исследование различных проблем, связанных с предметом сепсиса.
Abstract
Сепсис остается постоянной проблемой для отделений интенсивной терапии во всем мире. Понимание сложных механизмов сепсиса является предпосылкой для создания новых терапевтических подходов в этой области. Таким образом, животные модели требуются, которые способны точно имитировать человеческие болезни, а также достаточно иметь дело с научными вопросами. Колон Ascendens Стент Перитонит (CASP) является весьма стандартизированной модели для полимикробная абдоминального сепсиса у грызунов. В этой модели небольшое стент хирургически вставляются в восходящей ободочной кишки мышей или крыс приводит к непрерывной утечке кишечных бактерий в брюшную полость. Эта процедура приводит к перитониту, системной бактериемии, орган инфекции кишечника бактерий, и системные, но и местное высвобождение несколько про-и противовоспалительных цитокинов. Летальность CASP можно управлять с помощью диаметр вставлен стент. Вариант этой модели, так называемые CASP с вмешательством (Каспий), повышает возможность удалить септического очага на вторую операцию в соответствии с общими процедурами в клинической практике. CASP это легко можно научиться и высокой воспроизводимостью модель, которая точно имитирует клинического течения абдоминального сепсиса. Это приводит способ учиться на вопросы в нескольких научных областях, например, иммунологии, инфектологии, или хирургического вмешательства.
Protocol
1. Подготовка мышь
- Анестезию мыши, внутрибрюшинного введения наркотических жидкости (см. таблицу реагентов) и поместить его в лежачем положении.
- Ноги мыши должны быть исправлены с лентой на пластине для обеспечения устойчивого положения животного во время операции.
2. Операция
- Возьмите IV канюли, которая обычно используется для IV инъекции в организме человека, и вырезать его пластиковой трубки циркулярно 2 мм от его кончика. Мы используем три различных размеров канюль контролировать уровень смертности (BD Venflon 18GA (1,2 x45mm, 80 мл / мин); 16GA (1,7 x45mm, 180 мл / мин) 14GA (2,0 x45mm, 270 мл / мин)).
- После тщательной дезинфекции кожи живота, надрезать ее вдоль его средней линии около 15 мм. Открытое перитонеального пещере на надрезание мышцы живота и брюшину вдоль белой линии.
- Определить полюса слепой кишки и вытащить тщательно слепой кишки, подвздошной кишки и восходящей кишки из живота за счет использования ватные тампоны.
- 15 мм дистальнее илеоцекального клапана, нужно проткнуть стену восходящей ободочной кишки с 7 / 0 шва. Таким образом, поражения кишечника суда должны избегать. Шва устанавливается на толстой стене два хирургических узлов.
- Теперь прокол восходящей ободочной кишки с подготовленным канюли 1-2 мм от проксимального 7 / 0 шва. Осторожно вставьте канюлю в толстую кишку, пока борозду в пластиковой трубки находится на одном уровне с серозной.
- Положите свободные концы 7 / 0 шва вокруг канюли и место два раза узел точно в подготовленную борозду из пластиковой трубы.
- Теперь возьмите иглу 7 / 0 шва и стежка через antimesenteric стене толстой кишки. Последовательно, два хирургических узлов должны быть выполнены, чтобы дополнительно зафиксировать пластиковую трубку в толстой стене. Вырезать шов заканчивается.
- Получить железо часть канюли маленькие и вырезать пластиковую трубку с близким (1 мм) для крепления 7 / 0 шва.
- Теперь надо тщательно молока стула от слепой кишки к толстой кишки стента с помощью ватные тампоны, пока небольшая заметка стула появляется на верхней части стента.
- Положить кишки обратно в брюшную пещеру и performe инфузионной терапии путем внутрибрюшинного введения 0,5 мл физиологического раствора.
- Закрыть брюшины с непрерывным швом (4 / 0).
- Закрыть кожи с особыми швов (4 / 0).
3. Ведение послеоперационного периода
- Положите животное обратно в свою клетку, которая должна содержать достаточное количество пищи и воды. Для обезболивания, внутрибрюшинного введения мощным болеутоляющим веществом (мы используем бупренорфин) должны регулярно выполняться.
- В течение первых двух дней после операции, нужно контролировать животных каждые 6 часов.
4. Шам CASP
- Выполните шаги 1.1-2.4.
- Не прокол толстой кишки. Просто выполните шаги 2.6-2.8.
- Выполните шаги 2.10-3.2.
5. Каспий
- Выполните CASP использованием канюли 14G следующие шаги 1.1-3.1
- 5 часов после CASP, нужно работать животное снова. Подготовка и анестезию мыши опять же согласно шаги 1.1-1.2
- Открытые швы брюшной стенки.
- Вытяните восходящей ободочной кишки с стента вставлены.
- Аккуратно вырежьте Швы фиксации стента и удаления стента.
- Закрыть дефект в толстой кишке с одним обращением швов (7 / 0).
- Положить кишки обратно в брюшную полость и промойте последнем дважды по 10 мл физиологического раствора.
- Закрыть брюшины с непрерывным швом (4 / 0).
- Закрыть кожи с особыми швов (4 / 0).
- Выполните шаги 3.1-3.2
6. Представитель Результаты
В течение нескольких часов после операции, животных показывают клинические признаки начала сепсиса. Типичными симптомами болезни являются ограниченными физическими возможностями, ощетинившийся пальто, потливость, снижение потребления пищи, потеря веса, а также сократить бегство поведения. Животные развивается тяжелый перитонит с последовательной системной инфекции обычно умирают в течение 48 часов. В зависимости от вставлен стент размера, отличные показатели смертности могут быть получены. 14G стента приводит к 100% смертности, 16G дает 70% смертности и смертности на 50% может быть достигнута с помощью 18G стента (рис. 1а). Операции Шам результаты в выживаемости 100%. Как правило, все животные погибают промежуточные первые 48 часов после CASP. Таким образом, все животные, которые живы в это время точка может рассматриваться как оставшихся в живых. Однако, мы рекомендуем дополнительный период наблюдения, по крайней мере 72 часов, чтобы обнаружить редкие "конце смерти" после CASP.
Результаты Каспи зависит от периода времени после CASP, когда стент удаляется. 3ч после вмешательства CASP результаты в выживаемости 45%. Если стент удаляется 5ч после CASP, только 10%животные выживают процедуры. Стента после удаления 9ч приводит смертности на 100% (рис. 1b). Шам Каспи приводит к 100% выживаемости. Для настройки Каспи, мы рекомендуем наблюдения сроком на 10 дней, потому что обычно это животные, которые умирают позднее чем через 48 часа после CASP.
Макроскопические осмотр брюшной места нахождения имущества через 24 часа после CASP показаны типичные признаки перитонита: отеки, вазодилатация, эритематозные стену кишки, резкое разграничение Пейеровы бляшки, кишечник паралич, свободной жидкости, и септического секреции (рис. 2).
Системная инфекция может проявиться бактериологического анализа. 12 часов после CASP, массивные бактериальные количества могут быть обнаружены в брюшную промывание, крови, печени, легких, селезенки и почек. Качественный анализ показывает, бактерии системной инфекции типичными бактериями кишечника, как E. палочка, бактероиды видов, энтерококков видов и т.д. (рис. 3).
CASP вызванной сепсисом проявляется в местных, а также системные выпуск про-и противовоспалительных цитокинов и хемокинов. 12 часов после CASP, значительное количество ФНО, ИЛ-1β, IL-6, IL-10, MCP-1 и другие могут быть измерены с помощью ИФА в крови, но и в супернатантах орган суспензий, например, печени, легких, селезенки, почек (рис. 4).
При установлении CASP в вашей лаборатории, выживаемость, бактериологии и цитокина должны быть приняты в качестве контрольных параметров для правильного выполнения CASP. В дальнейшем эти параметры могут быть приняты как стандарт зачитал система для всех экспериментальных установок.
На рисунке 1а: Выживание после CASP. Выживаемость следующие CASP операции зависит от диаметра вставлен стент. 14G результаты CASP в смертность на 100%, 16G результаты CASP в 70% смертности и 18G CASP приводит к 50% смертности. Шам CASP связано с выживанию 100%. . п = 20/group B: Выживаемость следующие Каспи операции зависит от времени стента удаления. Стент удаление на 3 часа после 14G CASP приводит к смертности на 55%. Стент удаление на 5 часов после 14G CASP приводит к смертности на 90%, тогда как удаление стента в 9ч после 14G результаты CASP в 100% смертности. Шам Каспи (5 часов) приводит к выживанию 100%. п = 10/group (Шам Каспи, Каспи 9 часов), п = 20/group (3ч Каспи, 5h Каспи).
Рисунок 2: Брюшной 24h места нахождения имущества после CASP. Брюшная стенка была снята 24 часов после 16G CASP или фиктивных CASP, соответственно. Места нахождения имущества из мнимого работать мышь выглядит физиологической. В противоположность этому, CASP приводит отек, гиперемия, dilatated кишечника, и демаркации патчи Пейера демонстрируя серьезный перитонита.
Рисунок 3: бактериологии. CASP приводит к тяжелой инфекции из нескольких отсеков и органов по кишке бактерий в пределах 12 часов после операции. Бактериальные номера даются как колониеобразующих единиц (КОЕ) на мл, соответственно. Бактериальные культуры, взятых из мнимого работать мышей полностью стерильными (не показаны). 16G CASP, п = 5/group.
Рисунок 4: Цитокины. CASP вызывает системный иммунный ответ в виде нескольких цитокинов и хемокинов обнаруживаются в плазме, а также в орган супернатанты. На рисунке показано, образцово провоспалительных цитокинов, фактор некроза опухоли (ФНО) и интерлейкин-6 (ИЛ-6), а также преимущественно противовоспалительным Ил-10. 12 ч после CASP, замечательные уровни могут быть обнаружены в плазме крови, печени, легких и селезенке. Тем не менее, Ил-10 не могут быть обнаружены в легких и селезенке после CASP. Шам операция не приводит ни к каким секрецию цитокинов (не показаны). 16G CASP, п = 5/group.
Discussion
CASP является полимикробная модель абдоминального сепсиса, которая отвечает большинству критериев постулируется для ценной моделью сепсиса: CASP могут быть выполнены в мелких животных, очень воспроизводимые, легко контролировать по стандартным параметрам, обеспечивает хорошую зачитал возможности, и точно имитирует клиническую настройки абдоминального сепсиса. В сравнительном исследовании мы могли бы показать, что приводит к CASP разлитого перитонита с ранней и неуклонно растет системной инфекции и воспаления (синдром системного воспалительного ответа), тогда как слепой кишки перевязки и пункции (CLP) показывает модель внутрибрюшного абсцесса с устойчивым и незначительных признаков системного воспаления (1). Техника Каспий представляет возможность имитировать клинического течения перитонита с последовательным хирургического санитарии фокус, который является наиболее важным терапевтическим принципом у людей. CASP может быть применен для всех вопросов вокруг сепсис или перитонит и поэтому полезен для всех дисциплин дело с сепсисом исследований, например, иммунологии, фармакологии, хирургии, интенсивной терапии и т.д. подборку публикаций по различным предметам сепсиса использованием CASP модель приводится ниже (1-14).
При запуске с CASP, следует иметь в виду, что некоторые практики необходимо, чтобы выполнить операцию точно и быстро. Хирургический опыт может быть полезным, но не требуется. Мы рекомендуем обнаружения letality в качестве параметра для правильного выполнения CASP. Надо начать с 14G CASP как большой стент легче, чем более тонкой. Обученный хирург CASP может работать одна мышь в течение 10 минут. Перед началом любых экспериментов, вы должны убедиться, что вы находитесь рядом с этого периода. Когда вы получили некоторый опыт работы с хирургической процедуры, вы должны проводить выживания кинетической и проверить свои навыки. 14G CASP должны привести к 100% летальности. Новичков в нашей лаборатории, чтобы доказать, что они способны генерировать 100% летальности с 14G CASP, прежде чем начать с экспериментов. Кроме того, бактериологии и цитокинов измерения должны быть выполнены, чтобы проверить сепсиса. Если у вас есть проблемы, начиная с микрохирургической шаги CASP, использование лупы или операционного микроскопа может быть полезным. Но в принципе, CASP может быть также выполнена без этих утилит. Для воспроизводства наши цены на выживание, это абсолютно необходимо, чтобы те же самые материалы, особенно стентов (BD Venflon, см. ниже), которые используются. В противном случае существенного изменения результатов возможно. Кроме того, мы предполагаем, что могут быть изменения в зависимости от результатов, например, индивидуальность хирурга. Тем не менее, влияние таких факторов, как, что должно быть мало.
Таким образом, CASP является практически возможно, простой, воспроизводимой и ценные сепсис модель, которая имитирует тесно клинической ситуации абдоминального сепсиса. Именно поэтому подходит для всех областей сепсис исследований.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность Нико Zantl, Клаус Пфеффер, и Бернхард Holzmann. Это исследование было поддержано Deutsche Forschungsgemeinschaft, Бонне-Бад Годесберг, Германия (ГРК-840; Vo 450/10-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Narcotic fluid | Mix 0.5 mL Rompun with 4.0 mL Ketanest, and add 5.5 mL of saline solution (0.9%).For complete anesthesia, inject intraperitoneally 10 μL/g body weight | ||
| Rompun (20 mg/ml Xylazine) | Bayer AG | ||
| Ketanest (25mg/ml Esketamine) | Pfizer Pharma GmbH | 647028001E | |
| BD Venflon 18GA (1,2x45mm, 80ml/min) | BD Biosciences | 391457 | |
| BD Venflon 16GA (1,7x45mm, 180ml/min) | BD Biosciences | 391455 | |
| BD Venflon 14GA (2,0x45mm, 270ml/min) | BD Biosciences | 391456 | |
| Catgut Polyester 4/0 white, non absorbable | Catgut GmbH | 17218113 | |
| Mariderm black 7/0, non absorbable | Catgut GmbH | 18104900 |
References
- Maier, S., Traeger, T., Entleutner, M., Westerholt, A., Kleist, B., Huser, N., Holzmann, B., Stier, A., Pfeffer, K., Heidecke, C. D. Cecal ligation and puncture versus colon ascendens stent peritonitis: two distinct animal models for polymicrobial sepsis. Shock. 21, 505-511 (2004).
- Bougaki, M., Searles, R. J., Kida, K., Yu, J. D. e, Buys, E. S., Ichinose, F. NOS3 protects against systemic inflammation and myocardial dysfunction in murine polymicrobial sepsis. Shock. , (2009).
- Buras, J. A., Holzmann, B., Sitkovsky, M. Animal models of sepsis: setting the stage. Nat Rev Drug Discov. 4, 854-865 (2005).
- Busse, M., Traeger, T., Potschke, C., Billing, A., Dummer, A., Friebe, E., Kiank, C., Grunwald, U., Jack, R. S., Schutt, C., Heidecke, C. D., Maier, S., Broker, B. M. Detrimental role for CD4+ T lymphocytes in murine diffuse peritonitis due to inhibition of local bacterial elimination. Gut. 57, 188-195 (2008).
- Daubeuf, B., Mathison, J., Spiller, S., Hugues, S., Herren, S., Ferlin, W., Kosco-Vilbois, M., Wagner, H., Kirschning, C. J., Ulevitch, R., Elson, G. TLR4/MD-2 monoclonal antibody therapy affords protection in experimental models of septic shock. J Immunol. 179, 6107-6114 (2007).
- Entleutner, M., Traeger, T., Westerholt, A., Holzmann, B., Stier, A., Pfeffer, K., Maier, S., Heidecke, C. D. Impact of interleukin-12, oxidative burst, and iNOS on the survival of murine fecal peritonitis. Int J Colorectal Dis. 21, 64-70 (2006).
- Kerschen, E. J., Fernandez, J. A., Cooley, B. C., Yang, X. V., Sood, R., Mosnier, L. O., Castellino, F. J., Mackman, N., Griffin, J. H., Weiler, H. Endotoxemia and sepsis mortality reduction by non-anticoagulant activated protein. C. J Exp Med. 204, 2439-2448 (2007).
- Kiank, C., Koerner, P., Kessler, W., Traeger, T., Maier, S., Heidecke, C. D., Schuett, C. Seasonal variations in inflammatory responses to sepsis and stress in mice. Crit Care Med. 35, 2352-2358 (2007).
- Lustig, M. K., Bac, V. H., Pavlovic, D., Maier, S., Grundling, M., Grisk, O., Wendt, M., Heidecke, C. D., Lehmann, C. Colon ascendens stent peritonitis--a model of sepsis adopted to the rat: physiological, microcirculatory and laboratory changes. Shock. 28, 59-64 (2007).
- Traeger, T., Kessler, W., Assfalg, V., Cziupka, K., Koerner, P., Dassow, C., Breitbach, K., Mikulcak, M., Steinmetz, I., Pfeffer, K., Heidecke, C. D., Maier, S. Detrimental role of CC chemokine receptor 4 in murine polymicrobial sepsis. Infect Immun. 76, 5285-5293 (2008).
- Traeger, T., Kessler, W., Hilpert, A., Mikulcak, M., Entleutner, M., Koerner, P., Westerholt, A., Cziupka, K., Rooijen, N. van, Heidecke, C. D., Maier, S. Selective depletion of alveolar macrophages in polymicrobial sepsis increases lung injury, bacterial load and mortality but does not affect cytokine release. Respiration. 77, 203-213 (2009).
- Traeger, T., Mikulcak, M., Eipel, C., Abshagen, K., Diedrich, S., Heidecke, C. D., Maier, S., Vollmar, B. Kupffer cell depletion reduces hepatic inflammation and apoptosis but decreases survival in abdominal sepsis. Eur J Gastroenterol Hepatol. , (2010).
- Weighardt, H., Kaiser-Moore, S., Schlautkotter, S., Rossmann-Bloeck, T., Schleicher, U., Bogdan, C., Holzmann, B. Type I IFN modulates host defense and late hyperinflammation in septic peritonitis. J Immunol. 177, 5623-5630 (2006).
- Zantl, N., Uebe, A., Neumann, B., Wagner, H., Siewert, J. R., Holzmann, B., Heidecke, C. D., Pfeffer, K. Essential role of gamma interferon in survival of colon ascendens stent peritonitis, a novel murine model of abdominal sepsis. Infect Immun. 66, 2300-2309 (1998).
