Summary
El stent de colon ascendens Peritonitis (CASP) es un modelo altamente estandarizados para la sepsis abdominal polimicrobiana en los roedores. En este artículo se describe el procedimiento quirúrgico del CASP. El modelo CASP y sus variantes permiten la investigación sistemática de los diversos problemas relacionados con el tema de la sepsis.
Abstract
La sepsis sigue siendo un problema persistente en unidades de cuidados intensivos de todo el mundo. Comprensión de los mecanismos complejos de la sepsis es una condición previa para el establecimiento de nuevos enfoques terapéuticos en este campo. Por lo tanto, los modelos animales se requiere que sean capaces de imitar de cerca la enfermedad humana y también lo suficientemente lidiar con cuestiones científicas. El stent de colon ascendens Peritonitis (CASP) es un modelo altamente estandarizados para la sepsis abdominal polimicrobiana en los roedores. En este modelo, un pequeño stent se inserta quirúrgicamente en el colon ascendente de ratas o ratones que conduce a una fuga continua de las bacterias intestinales en la cavidad peritoneal. Los resultados del procedimiento en la bacteriemia peritonitis, sistémica, la infección de órganos por las bacterias intestinales, y la liberación sistémica, sino también locales de varias citoquinas pro-y anti-inflamatorios. La letalidad del CASP pueden ser controlados por el diámetro de la prótesis. Una variante de este modelo, el CASP llamada con la intervención (Caspi), plantea la oportunidad de eliminar el foco séptico por una segunda operación según los procedimientos habituales en la práctica clínica. CASP es un modelo fácilmente se puede aprender y altamente reproducible que imita el curso clínico de la sepsis abdominal. Esto lleva camino para estudiar en las cuestiones científicas en varios campos de inmunología, por ejemplo, la infectología, o cirugía.
Protocol
1. Preparación del ratón
- Anestesiar a los ratones por vía intraperitoneal del líquido narcótico (ver tabla de reactivos) y colocarlo en posición supina.
- Los pies del ratón necesidad de fijar con cinta adhesiva en la placa para asegurar una posición estable de los animales durante la operación.
2. Funcionamiento
- Tome una cánula iv, que se utiliza habitualmente para inyecciones intravenosas en los seres humanos, y tallar su tubo de plástico circular de 2 mm de la punta. Usamos tres diferentes tamaños de cánulas para controlar las tasas de mortalidad (BD Venflon 18GA (1,2 x45mm, 80 ml / min); 16GA (1,7 x45mm, 180 ml / min) calibre 14 (2,0 x45mm, 270 ml / min)).
- Después de la desinfección profunda de la piel abdominal, una incisión a lo largo de su línea media de alrededor de 15mm. Abrir la caverna peritoneal por una incisión en los músculos abdominales y el peritoneo a lo largo de la línea alba.
- Identifique el polo cecal y sacar con cuidado el ciego, íleon terminal y colon ascendente fuera del abdomen por el uso de hisopos de algodón.
- 15 mm distal de la válvula ileocecal, se tiene que perforar la pared del colon ascendente con una sutura de 7 / 0. De esta manera, las lesiones de los vasos del intestino tienen que ser evitados. La sutura se fija en la pared del colon por dos nudos quirúrgicos.
- Ahora perforar el colon ascendente con el preparado cánula 1-2 mm proximal de la sutura 7 / 0. Introduzca con cuidado la cánula en el colon hasta el surco en el tubo de plástico a la altura de la serosa.
- Ponga los extremos libres de la sutura 7 / 0 alrededor de la cánula y el lugar un nudo doble exactamente en el surco preparado del tubo de plástico.
- Ahora, toma la aguja de la sutura 7 / 0 y lo cose a través de la pared antimesentérico del colon. Forma consecutiva, dos nudos quirúrgicos deben llevarse a cabo para fijar, además, el tubo de plástico en la pared del colon. Corte los extremos de sutura.
- Recuperar la parte de hierro de la cánula un poco y cortar el tubo de plástico de cierre (1 mm) a la fijación 7 / 0 sutura.
- Ahora es el momento de la leche con cuidado las heces del intestino ciego hacia el stent de colon por el uso de hisopos de algodón hasta la punta pequeña de heces aparece en la parte superior de la prótesis.
- Ponga el intestino de nuevo en la caverna peritoneal y reanimación Realizamos el líquido por la administración intraperitoneal de 0,5 ml de solución salina.
- Cerrar el peritoneo con una sutura continua (4 / 0).
- Cerca de la piel con suturas singular (4 / 0).
3. Cuidado Postoperatorio
- Vuelva a colocar el animal en su jaula, el cual debe contener suficiente alimento y agua. Para la analgesia, la administración intraperitoneal de una sustancia potente analgésico (usamos la buprenorfina) debe ser realizado regularmente.
- Dentro de los primeros dos días después de la operación, uno tiene que controlar a los animales cada 6 horas.
4. Sham CASP
- Siga los pasos 1.1-2.4.
- No perfore el colon. Sólo realice los pasos 2.6-2.8.
- Siga los pasos 2.10-3.2.
5. Caspi
- CASP realizar utilizando una cánula 14G siguientes pasos 1.1-3.1
- 5h después de CASP, se tiene que operar al animal una vez más. Preparar y anestesiar el ratón de nuevo siguiendo los pasos 1.1-1.2
- Abrir las suturas de la pared abdominal.
- Saque el colon ascendente con la prótesis.
- Corte cuidadosamente las suturas de fijación del stent y retirar el stent.
- Cerrar el defecto en el colon con un solo puntos invertidos (7 / 0).
- Poner el intestino en la cavidad abdominal y el rubor de la última dos veces con 10 ml de solución salina.
- Cerrar el peritoneo con una sutura continua (4 / 0).
- Cerca de la piel con suturas singular (4 / 0).
- Siga los pasos 3.1-3.2
6. Resultados representante
A las pocas horas después de la operación, los animales muestran signos clínicos de sepsis principio. Los síntomas típicos de la enfermedad se reduce la movilidad, la capa erizado, sudoración, disminución de la ingesta de alimentos, pérdida de peso y el comportamiento también se reduce la huida. Los animales el desarrollo de una peritonitis grave con infección sistémica consecutivos normalmente mueren en 48 horas. Dependiendo del tamaño inserta un stent, las tasas de mortalidad diferentes pueden ser generados. A los resultados 14G stent en el 100% de mortalidad, 16G ofrece un 70% la mortalidad y las tasas de mortalidad del 50% se puede alcanzar mediante el uso de un stent 18G (Figura 1a). Los resultados de la operación simulada de una tasa de supervivencia del 100%. Por lo general, todos los animales mueren entre medio de las primeras 48 horas después de la CASP. Por lo tanto, todos los animales que están vivos en este momento el tiempo se puede considerar como supervivientes. Sin embargo, se recomienda un período de observación adicional de al menos 72 horas para detectar raras "muertes tardías" después de CASP.
El resultado de Caspi depende del período de tiempo después del CASP, cuando el tubo se quita. Una intervención 3h después de los resultados CASP en una tasa de supervivencia del 45%. Si el stent se retira después de 5h CASP, sólo el 10% delos animales sobreviven al procedimiento. El retiro del stent tras los resultados 9h en una mortalidad del 100% (Figura 1b). Sham Caspi conduce a la supervivencia del 100%. Para la configuración de Caspi, se recomienda un período de observación de 10 días debido a que por lo general son animales, que mueren a más tardar 48 horas después del CASP.
Inspección macroscópica de la abdominal situs 24 horas después de CASP muestra signos típicos de peritonitis: edema, la vasodilatación, la pared intestinal eritematoso, definida demarcación de las placas de Peyer, parálisis intestinal, líquido libre, y la secreción séptico (Figura 2).
La infección sistémica puede ser demostrado por análisis bacteriológicos. 12 horas después del CASP, enormes cantidades de bacterias puede ser detectado en el lavado peritoneal, la sangre, hígado, pulmón, bazo y riñones. El análisis cualitativo de las bacterias revela una infección sistémica por las bacterias intestinales típicos como E. coli, bacteroides especies, especies de Enterococcus, etc (Figura 3).
CASP inducida por sepsis manifiesta en la liberación local y sistémica también de citoquinas pro-y anti-inflamatorias y quimiocinas. 12 horas siguientes cantidades CASP, significativa de TNF, IL-1β, IL-6, IL-10, MCP-1 y otros pueden ser medidos por ELISA en sangre, sino también en los sobrenadantes de las suspensiones de órganos, como hígado, pulmón, bazo, riñón (Fig. 4).
Al establecer CASP en su laboratorio, las tasas de supervivencia, la bacteriología y la liberación de citoquinas se debe tomar como parámetros de control para la correcta realización del CASP. Más tarde, estos parámetros se pueden tomar como estándar de lectura de sistema para todos los parámetros experimentales.
Figura 1a: supervivencia después de CASP. Las tasas de supervivencia después de la cirugía CASP depende del diámetro de la prótesis. 14G resultados CASP en una tasa de mortalidad del 100%, los resultados 16G CASP en el 70% de mortalidad, y CASP 18G conduce a la mortalidad del 50%. Sham CASP se asocia con una supervivencia del 100%. . n = 20/group B: Las tasas de supervivencia después de la cirugía Caspi dependerá del momento de la remoción del stent. Remoción del stent en 3 horas después de 14G CASP conduce a una tasa de mortalidad del 55%. Remoción del stent a las 5h después de 14G resultados CASP en una tasa de mortalidad de 90%, mientras que la eliminación del stent a las 9h después de los resultados CASP 14G en 100% de mortalidad. Sham Caspi (5h) da como resultado una supervivencia del 100%. n = 10/group (Sham Caspi, Caspi 9h), n = 20/group (3h Caspi, Caspi 5h).
Figura 2: 24 situs abdominal después de CASP. La pared abdominal fue removido 24 horas después de 16G CASP o CASP farsa, respectivamente. El situs del ratón operación simulada se ve fisiológicas. Por el contrario, los resultados en el CASP edema, hiperemia entrañas, dilatados, y la demarcación de las placas de Peyer demostrar peritonitis grave.
Figura 3: Bacteriología. CASP conduce a la infección severa de varios compartimentos y órganos por las bacterias intestinales dentro de 12 horas después de la operación. El número de bacterias se dan como unidades formadoras de colonias (ufc) por ml, respectivamente. Cultivos de bacterias tomadas de ratones con operación simulada son completamente estériles (no mostrado). 16G CASP, n = 5/grupo.
Figura 4: Las citoquinas. CASP desencadena una respuesta inmune sistémica como varias citocinas y quimiocinas son detectables en el plasma y en los sobrenadantes de órganos. La figura muestra ejemplar de las citoquinas pro-inflamatorias factor de necrosis tumoral (TNF) y la interleucina 6 (IL-6), así como los predominantemente anti-inflamatorias IL-10. 12 horas después de la CASP, niveles notables pueden ser detectados en plasma, hígado, pulmones y el bazo. Sin embargo, la IL-10 no puede ser detectado en el pulmón y el bazo después de CASP. Operación simulada no conduce a ninguna secreción de citoquinas (no mostrado). 16G CASP, n = 5/grupo.
Discussion
CASP es un modelo polimicrobiana de la sepsis abdominal que cumple con los criterios de la mayoría de los postulados de un modelo de sepsis valioso: CASP se puede realizar en pequeños animales, es altamente reproducible y fácil de controlar por los parámetros estándar, proporciona una buena lectura de las posibilidades, y se asemeja mucho a situaciones clínicas de sepsis abdominal. En un estudio comparativo que podría demostrar que CASP lleva a peritonitis difusa con infección temprana y de manera constante cada vez mayor y la inflamación sistémica (síndrome de respuesta inflamatoria sistémica), mientras que la ligadura y punción cecal (CLP) revela un modelo de formación de abscesos intra-abdominal con sostenido y menor signos de inflamación sistémica (1). La técnica de Caspi presenta la posibilidad de simular la evolución clínica de la peritonitis con el saneamiento consecutivos enfoque quirúrgico, que es el principio terapéutico más importante en los seres humanos. CASP se puede aplicar a todas las preguntas en torno a la sepsis o peritonitis y es útil para todas las disciplinas relacionadas con la investigación de la sepsis, por ejemplo, inmunología, farmacología, cirugía, medicina de cuidados intensivos, etc Una selección de publicaciones sobre diferentes temas de la sepsis con el modelo de CASP A continuación se da (1-14).
Al comenzar con el CASP, uno debe ser consciente de que un poco de práctica es necesaria para realizar la operación con exactitud y rapidez. La experiencia quirúrgica puede ser útil, pero no es necesario. Se recomienda la detección de letalidad como parámetro para la correcta realización del CASP. Uno debe comenzar con el CASP 14G como un stent grandes es más fácil de manejar que un más delgado. Un cirujano CASP entrenado es capaz de operar un ratón dentro de 10 minutos. Antes de comenzar cualquier experimento, usted debe asegurarse de que está cerca de ese período. Cuando alguna experiencia con el procedimiento quirúrgico, debe realizar una cinética de supervivencia para ver sus habilidades. 14G CASP debe dar lugar a una mortalidad del 100%. Los principiantes en nuestro laboratorio tiene que demostrar que son capaces de generar una letalidad del 100% con el CASP 14G antes de comenzar con los experimentos. Además, la bacteriología y la medición de citoquinas se debe realizar para verificar la sepsis. Si usted tiene problemas en el principio con los pasos de microcirugía del CASP, el uso de lentes de aumento o un microscopio quirúrgico puede ser útil. Pero, en principio, CASP puede ser bien realizado sin estos servicios. Para la reproducción de nuestras tasas de supervivencia, es absolutamente necesario que los mismos materiales, especialmente los stents (BD Venflon, ver más abajo), se utilizan. De lo contrario, variaciones sustanciales de los resultados son posibles. Además, se sugiere que puede haber variaciones de los resultados en función de, por ejemplo, la individualidad del cirujano. Sin embargo, la influencia de factores como que debe ser pequeña.
En resumen, CASP es un modelo posible, sepsis simple, reproducible y valioso que imita de cerca la situación clínica de sepsis abdominal. Por lo tanto, apto para todos los campos de investigación de la sepsis.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Nico Zantl, Pfeffer Klaus, y Holzmann Bernhard. Este estudio fue financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft, Bonn-Bad Godesberg, Alemania (GRK-840, Vo 450/10-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Narcotic fluid | Mix 0.5 mL Rompun with 4.0 mL Ketanest, and add 5.5 mL of saline solution (0.9%).For complete anesthesia, inject intraperitoneally 10 μL/g body weight | ||
| Rompun (20 mg/ml Xylazine) | Bayer AG | ||
| Ketanest (25mg/ml Esketamine) | Pfizer Pharma GmbH | 647028001E | |
| BD Venflon 18GA (1,2x45mm, 80ml/min) | BD Biosciences | 391457 | |
| BD Venflon 16GA (1,7x45mm, 180ml/min) | BD Biosciences | 391455 | |
| BD Venflon 14GA (2,0x45mm, 270ml/min) | BD Biosciences | 391456 | |
| Catgut Polyester 4/0 white, non absorbable | Catgut GmbH | 17218113 | |
| Mariderm black 7/0, non absorbable | Catgut GmbH | 18104900 |
References
- Maier, S., Traeger, T., Entleutner, M., Westerholt, A., Kleist, B., Huser, N., Holzmann, B., Stier, A., Pfeffer, K., Heidecke, C. D. Cecal ligation and puncture versus colon ascendens stent peritonitis: two distinct animal models for polymicrobial sepsis. Shock. 21, 505-511 (2004).
- Bougaki, M., Searles, R. J., Kida, K., Yu, J. D. e, Buys, E. S., Ichinose, F. NOS3 protects against systemic inflammation and myocardial dysfunction in murine polymicrobial sepsis. Shock. , (2009).
- Buras, J. A., Holzmann, B., Sitkovsky, M. Animal models of sepsis: setting the stage. Nat Rev Drug Discov. 4, 854-865 (2005).
- Busse, M., Traeger, T., Potschke, C., Billing, A., Dummer, A., Friebe, E., Kiank, C., Grunwald, U., Jack, R. S., Schutt, C., Heidecke, C. D., Maier, S., Broker, B. M. Detrimental role for CD4+ T lymphocytes in murine diffuse peritonitis due to inhibition of local bacterial elimination. Gut. 57, 188-195 (2008).
- Daubeuf, B., Mathison, J., Spiller, S., Hugues, S., Herren, S., Ferlin, W., Kosco-Vilbois, M., Wagner, H., Kirschning, C. J., Ulevitch, R., Elson, G. TLR4/MD-2 monoclonal antibody therapy affords protection in experimental models of septic shock. J Immunol. 179, 6107-6114 (2007).
- Entleutner, M., Traeger, T., Westerholt, A., Holzmann, B., Stier, A., Pfeffer, K., Maier, S., Heidecke, C. D. Impact of interleukin-12, oxidative burst, and iNOS on the survival of murine fecal peritonitis. Int J Colorectal Dis. 21, 64-70 (2006).
- Kerschen, E. J., Fernandez, J. A., Cooley, B. C., Yang, X. V., Sood, R., Mosnier, L. O., Castellino, F. J., Mackman, N., Griffin, J. H., Weiler, H. Endotoxemia and sepsis mortality reduction by non-anticoagulant activated protein. C. J Exp Med. 204, 2439-2448 (2007).
- Kiank, C., Koerner, P., Kessler, W., Traeger, T., Maier, S., Heidecke, C. D., Schuett, C. Seasonal variations in inflammatory responses to sepsis and stress in mice. Crit Care Med. 35, 2352-2358 (2007).
- Lustig, M. K., Bac, V. H., Pavlovic, D., Maier, S., Grundling, M., Grisk, O., Wendt, M., Heidecke, C. D., Lehmann, C. Colon ascendens stent peritonitis--a model of sepsis adopted to the rat: physiological, microcirculatory and laboratory changes. Shock. 28, 59-64 (2007).
- Traeger, T., Kessler, W., Assfalg, V., Cziupka, K., Koerner, P., Dassow, C., Breitbach, K., Mikulcak, M., Steinmetz, I., Pfeffer, K., Heidecke, C. D., Maier, S. Detrimental role of CC chemokine receptor 4 in murine polymicrobial sepsis. Infect Immun. 76, 5285-5293 (2008).
- Traeger, T., Kessler, W., Hilpert, A., Mikulcak, M., Entleutner, M., Koerner, P., Westerholt, A., Cziupka, K., Rooijen, N. van, Heidecke, C. D., Maier, S. Selective depletion of alveolar macrophages in polymicrobial sepsis increases lung injury, bacterial load and mortality but does not affect cytokine release. Respiration. 77, 203-213 (2009).
- Traeger, T., Mikulcak, M., Eipel, C., Abshagen, K., Diedrich, S., Heidecke, C. D., Maier, S., Vollmar, B. Kupffer cell depletion reduces hepatic inflammation and apoptosis but decreases survival in abdominal sepsis. Eur J Gastroenterol Hepatol. , (2010).
- Weighardt, H., Kaiser-Moore, S., Schlautkotter, S., Rossmann-Bloeck, T., Schleicher, U., Bogdan, C., Holzmann, B. Type I IFN modulates host defense and late hyperinflammation in septic peritonitis. J Immunol. 177, 5623-5630 (2006).
- Zantl, N., Uebe, A., Neumann, B., Wagner, H., Siewert, J. R., Holzmann, B., Heidecke, C. D., Pfeffer, K. Essential role of gamma interferon in survival of colon ascendens stent peritonitis, a novel murine model of abdominal sepsis. Infect Immun. 66, 2300-2309 (1998).
