Summary
קולון Ascendens סטנט דלקת הצפק (CASP) הוא מודל סטנדרטי ביותר עבור אלח דם בטן polymicrobial במכרסמים. מאמר זה מתאר את הליך כירורגי של CASP. המודל CASP גירסאותיה, לאפשר חקירה שיטתית של בעיות שונות לגבי הנושא של אלח דם.
Abstract
אלח דם נותרה בעיה מתמשכת על ביחידות לטיפול נמרץ בכל רחבי העולם. הבנת המנגנונים המורכבים של אלח דם היא תנאי מוקדם להקמת גישות טיפוליות חדשות בתחום זה. לכן, במודלים של בעלי חיים נדרשים כי הם מסוגלים לחקות את המחלה מקרוב האדם גם מספיק להתמודד עם שאלות מדעיות. קולון Ascendens סטנט דלקת הצפק (CASP) הוא מודל סטנדרטי ביותר עבור אלח דם בטן polymicrobial במכרסמים. במודל זה, סטנט קטן מוכנס בניתוח לתוך המעי הגס עולה של עכברים או חולדות המוביל דליפה מתמדת של חיידקים במעיים לתוך חלל הצפק. ההליך תוצאות bacteraemia, דלקת הצפק מערכתית, זיהום על ידי חיידקים במעיים איבר, ולשחרר מערכתי אלא גם מקומית של ציטוקינים תומכי ואנטי דלקתיים שונים. הקטלניות של CASP יכול להיות נשלט על ידי בקוטר של סטנט מוכנס. גרסה של מודל זה, CASP שנקרא עם התערבות (כספי), מעלה את האפשרות להסיר את הפוקוס ספיגה על ידי פעולה נוספת על פי נהלים משותפים הקלינית. CASP הוא מודל learnable בקלות לשחזור מאוד כי מקרוב מחקה את המסלול הקליני של אלח דם הבטן. הוא מוביל דרך ללמוד על שאלות מדעיות בתחומים שונים כגון: אימונולוגיה, infectiology, או ניתוח.
Protocol
1. הכנת עכבר
- להרדים את העכבר באמצעות זריקה intraperitoneal של נוזל נרקוטיים (ראה טבלה של ריאגנטים) ולמקם אותו במצב שכיבה.
- הרגליים של העכבר צריך להיות קבוע עם סרט על הצלחת כדי להבטיח עמדה יציבה של החיה במהלך המבצע.
2. מבצע
- קח צינורית iv, אשר נמצא בשימוש נפוץ אצל בני אדם עבור iv זריקות, ו לגלף צינור פלסטיק שלה מעגלית 2mm מקצהו. אנו משתמשים בשלושה גדלים שונים של cannulas לשלוט שיעורי התמותה (BD Venflon 18GA (1,2 x45mm, 80 mL / min); 16GA (1,7 x45mm, 180 mL / min) 14GA (2,0 x45mm, 270 mL / min)).
- לאחר חיטוי יסודי של עור הבטן, לחתוך אותה לאורך קו האמצע שלה על 15mm. פתח את המערה הצפק על ידי חריטה שרירי הבטן ואת הצפק לאורך linea alba.
- זהה את מוט cecal ולשלוף בזהירות cecum, מסוף מעי הגס עולה מתוך הבטן על ידי שימוש צמר גפן.
- 15mm דיסטלי של השסתום ileocecal, צריך לחדור את החומה של המעי הגס עולה עם תפר 7 / 0. ובכך, נגעים של כלי הבטן צריך להימנע. תפר הוא קבוע על הקיר הגס בשני קשרים כירורגית.
- עכשיו לנקב את המעי הגס עולה עם 1-2 מ"מ מוכן הצינורית הפרוקסימלית מ תפר 7 / 0. בזהירות להכניס את הצינורית לתוך המעי הגס עד תלם בצינור פלסטיק ברמה עם serosa.
- שים את הקצוות ללא תפר 7 / 0 סביב צינורית והמקום קשר כפולה בדיוק לתוך התלם מוכן צינור פלסטיק.
- עכשיו, לקחת את המחט של תפר 7 / 0 ו לתפור אותו דרך הקיר antimesenteric של המעי הגס. ברציפות, שני קשרים כירורגית צריך להתבצע עד ובנוסף לתקן את צינור פלסטיק בקיר המעי הגס. חותכים את הקצוות לתפור.
- אחזר את חלק הברזל של צינורית קטנה וחתך את צינור הפלסטיק קרוב (1 מ"מ) כדי לתקן את 7 / 0 תפר.
- עכשיו יש צורך בזהירות חלב שרפרף מ cecum כלפי סטנט המעי הגס על ידי שימוש ספוגיות כותנה עד קצה שרפרף קטן מופיע על גבי תומכן.
- שים את המעיים בחזרה לתוך המערה הצפק ו החייאה performe נוזל ידי הממשל intraperitoneal של 0.5 מ"ל של תמיסת מלח.
- סגור את הצפק עם תפר מתמשך (4 / 0).
- סגור את העור עם התפרים יחיד (4 / 0).
3. טיפול לאחר הניתוח
- להחזיר את החיה בכלוב שלה, אשר אמור להכיל מזון, מים מספיק. עבור כאבים, הממשל intraperitoneal של חומר משכך כאבים חזק (אנחנו משתמשים עצירות) יש לבצע על בסיס קבוע.
- בתוך היומיים הראשונים לאחר הניתוח, יש לשלוט על חיות כל 6 שעות.
4. שאם CASP
- בצע צעדים 1.1-2.4.
- אין לנקב את המעי הגס. רק לבצע פעולות 2.6-2.8.
- בצע צעדים 2.10-3.2.
5. כספי
- בצע CASP באמצעות בעקבות 14G צינורית צעדים 1.1-3.1
- 5 שעות לאחר CASP, יש להפעיל את החיה שוב. הכן להרדים את העכבר שוב לפי שלבים 1.1-1.2
- פתח את התפרים של דופן הבטן.
- משוך את המעי הגס עולה עם סטנט מוכנס.
- בזהירות לחתוך את התפרים תיקון סטנט ולהסיר את הסטנט.
- סגור את הפגם במעי הגס עם התפרים היפוך יחיד (7 / 0).
- שים את המעיים בחזרה לתוך חלל הבטן ואת הסומק האחרון פעמיים עם 10 מ"ל של תמיסת מלח.
- סגור את הצפק עם תפר מתמשך (4 / 0).
- סגור את העור עם התפרים יחיד (4 / 0).
- בצע את הפעולות 3.1-3.2
6. נציג תוצאות
תוך כמה שעות לאחר הניתוח, בעלי חיים מראים סימנים קליניים של ספסיס התחלה. סימפטומים אופייניים של המחלה מופחתים, ניידות מעיל horrent, הזעה, וירידה בצריכת המזון, אובדן משקל מופחת גם התנהגות מילוט. בעלי חיים לפתח דלקת הצפק חמורה עם זיהום מערכתי רצופים בדרך כלל מתים תוך 48h. בהתאם לגודל מוכנס הסטנט, שיעורי התמותה מובהק יכול להיות שנוצר. תוצאות סטנט 14G בתמותה 100%, 16G נותן התמותה 70%, ושיעורי תמותה של 50% ניתן להגיע באמצעות סטנט 18G (איור 1 א). תוצאות המבצע שאם שיעור הישרדות של 100%. בדרך כלל, כל בעלי החיים מתים inbetween הראשון 48 שעות אחרי CASP. לפיכך, כל בעלי החיים כי הם בחיים בשלב זה זמן יכול להיחשב הניצולים. עם זאת, אנו ממליצים על תקופת תצפית נוספת של לפחות 72 שעות כדי לזהות נדיר "מוות מאוחר" לאחר CASP.
התוצאה של כספי תלוי פרק הזמן לאחר CASP כאשר סטנט מוסר. התערבות 3h לאחר תוצאות CASP בשיעור ההישרדות של 45%. אם סטנט מוסר 5h לאחר CASP, רק 10%החיות לשרוד את ההליך. הסרת סטנט לאחר תוצאות 9h בתמותה של 100% (איור 1b). שאם כספי מוביל הישרדות 100%. עבור הגדרות כספי, אנו ממליצים על תקופת תצפית של 10 ימים כי אין בדרך כלל הם בעלי חיים, אשר למות יאוחר מ 48 שעות לאחר CASP.
בדיקה מקרוסקופית של הבטן מנח 24 שעות לאחר CASP מראה סימנים אופייניים של דלקת הצפק: בצקת, vasodilatation, קיר הבטן erythematic, תיחום חד של טלאים של Peyer, שיתוק מעיים, נוזל חופשי, הפרשת ספיגה (איור 2).
זיהום מערכתי ניתן להראות על ידי ניתוח בקטריולוגית. 12 שעות לאחר CASP, כמויות חיידקים מסיבי ניתן להבחין שטיפה פריטוניאלית, דם, הכבד, הריאות, הטחול והכליות. ניתוח איכותני של חיידקים מגלה זיהום מערכתי על ידי חיידקים במעיים טיפוסי כמו E. coli, bacteroides מינים, מינים אנטרוקוקוס, וכו '(איור 3).
CASP-Induced אלח דם מתבטא שחרור המקומית מערכתית גם של ציטוקינים chemokines הפרו ואנטי דלקתיים. 12 השעות הבאות, CASP כמויות משמעותיות של TNF, IL-1β, IL-6, IL-10, MCP-1 ואחרים ניתן למדוד ELISA בדם, אלא גם supernatants של המתלים איברים, כגון הכבד, הריאות, טחול, כליות (איור 4).
בעת הקמת CASP במעבדה שלך, שיעורי ההישרדות, בקטריולוגיה ושחרור ציטוקינים צריך לקחת שליטה על פרמטרים כמו ביצועים הנכון של CASP. מאוחר יותר, פרמטרים אלה ניתן לקחת כסטנדרט הקריא את כל הגדרות המערכת עבור הניסוי.
איור 1a: הישרדות לאחר CASP. שיעורי ההישרדות לאחר הניתוח CASP תלוי בקוטר של סטנט מוכנס. 14G תוצאות CASP שיעור תמותה של 100%, התוצאות CASP 16G בתמותה 70%, ו CASP 18G מוביל לתמותה של 50%. שאם CASP קשורה הישרדות של 100%. . n = 20/group ב ': שיעורי ההישרדות לאחר הניתוח כספי תלוי בזמן הסרת סטנט. הסרת סטנט ב 3h לאחר 14G CASP מוביל שיעור תמותה של 55%. הסרת סטנט ב 5 שעות לאחר 14G תוצאות CASP בשיעור התמותה של 90% ואילו הסרת סטנט ב 9h לאחר תוצאות CASP 14G ב 100% תמותה. שאם כספי (5 שעות) תוצאות ההישרדות של 100%. n = 10/group (שאם כספי; כספי 9h), n = 20/group (3h כספי; 5h כספי).
איור 2: 24 שעות מנח בטן לאחר CASP. דופן הבטן הוסר לאחר 24 שעות 16G CASP או אחיזת עיניים CASP, בהתאמה. מנח של העכבר מזויף פעלו נראה פיזיולוגיים. לעומת זאת, תוצאות CASP ב בצקת, hyperemia, המעיים dilatated, ועל תיחום טלאים של Peyer הוכחת חמורה דלקת הצפק.
איור 3: בקטריולוגיה. CASP גורמת זיהום חמור של מספר תאים ואיברים ידי חיידקים במעיים בתוך 12 שעות לאחר הניתוח. מספרים חיידקית מקבלים כיחידות המושבה להרכיב (CFU) לכל מ"ל, בהתאמה. תרביות חיידקים שנלקחו עכברים מזויף פעלו הם סטריליים לחלוטין (לא מוצג). 16G CASP, n = 5/group.
איור 4: ציטוקינים. CASP מעורר תגובה חיסונית מערכתית כמו ציטוקינים מספר chemokines הם להבחין פלזמה וגם supernatants איברים. הדמות exemplarily מציגה את הפרו ציטוקינים דלקתיים גורם נמק הגידול (TNF) ו - interleukin-6 (IL-6), כמו גם את בעיקר אנטי דלקתיות IL-10. 12 שעות לאחר CASP, רמות מדהים ניתן לאתר בפלסמה, הכבד, הריאות, הטחול. עם זאת, IL-10 לא ניתן לאתר הריאות והטחול לאחר CASP. פעולה שאם אינה מובילה הפרשת ציטוקינים כלשהו (לא מוצג). 16G CASP, n = 5/group.
Discussion
CASP הוא מודל polymicrobial של אלח דם בטן שעונה לקריטריונים הניחו ביותר עבור מודל אלח דם יקר: CASP ניתן לבצע חיות קטנות, הוא לשעתקו מאוד, לפקח בקלות על ידי פרמטרים סטנדרטיים, מספק טוב לקרוא את האפשרויות, וכן מקרוב מחקה במסגרות קליניות של בטן אלח דם. במחקר השוואתי יכולנו להראות כי CASP מוביל מפוזר עם דלקת הצפק מוקדם מערכתית בהתמדה ודלקת (תגובה מערכתית תסמונת דלקת), ואילו קשירת לנקב cecal ו (CLP) חושפת מודל של היווצרות מורסה התוך בטני ממושך עם ומשניות סימנים של דלקת מערכתית (1). הטכניקה של כספי מציג אפשרות לדמות את המסלול הקליני של הצפק עם תברואה ברציפות להתמקד כירורגית, המהווה את העיקרון הטיפולי החשוב ביותר אצל בני אדם. CASP יכול להיות מיושם על כל השאלות סביב אלח דם או דלקת הצפק ולכן הוא שימושי עבור כל התחומים העוסקים במחקר אלח דם, למשל אימונולוגיה, פרמקולוגיה, ניתוחים, תרופות לטיפול נמרץ ועוד מבחר של פרסומים הנוגעים בנושאים שונים של אלח דם באמצעות מודל CASP היא כדלקמן (14/01).
כאשר החל CASP, אחד צריך להיות מודע לכך בפועל כמה הוא הכרחי כדי לבצע את הפעולה בדיוק ובמהירות. ניסיון כירורגי עשוי להיות מועיל, אך לא נדרש. אנו ממליצים זיהוי של letality כפרמטר לביצוע נכון של CASP. אחד צריך להתחיל עם CASP 14G כמו סטנט גדול יותר קל לטפל מאשר רזה אחד. מנתח CASP מאומן הוא מסוגל לפעול אחד העכבר תוך 10 דקות. לפני תחילת כל ניסוי, אתה צריך לוודא שאתה ליד תקופה. כאשר אתה צבר קצת ניסיון עם ההליך הכירורגי, אתה צריך לנהל הקינטית הישרדות כדי לבדוק את היכולות שלך. 14G CASP צריך לגרום הקטלניות של 100%. למתחילים במעבדה שלנו יש להוכיח כי הם מסוגלים להפיק הקטלניות 100% עם CASP 14G לפני שהם מתחילים עם הניסויים. בנוסף, בקטריולוגיה ומדידות ציטוקינים יש לבצע כדי לוודא אלח דם. אם יש לך בעיות בהתחלה עם הצעדים microsurgical של CASP, השימוש בזכוכית מגדלת או מיקרוסקופ כירורגי עשוי להיות מועיל. אבל המנהלת, CASP יכול להתבצע גם בלי הכלים הללו. עבור שעתוק של שיעורי ההישרדות שלנו, זה הכרחי כי אותם חומרים, בעיקר סטנטים (BD Venflon, ראה להלן), משמשים. אחרת, וריאציות משמעותי של התוצאות אפשרי. בנוסף, אנו מציעים כי ייתכנו שינויים של התוצאות בהתאם, למשל, את האינדיבידואליות של המנתח. עם זאת, ההשפעה של גורמים כאלה צריך להיות קטן.
לסיכום, CASP הוא מודל מעשי, אלח דם פשוטה, לשחזור ובעל ערך המחקה מקרוב את המצב הקליני של אלח דם הבטן. לכן זה מתאים בכל תחומי המחקר אלח דם.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
המחברים מודים ניקו Zantl, קלאוס פפר, ו ברנהרד הולצמן. מחקר זה נתמך על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה, בון-Bad Godesberg, גרמניה (GRK-840; וו 450/10-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Narcotic fluid | Mix 0.5 mL Rompun with 4.0 mL Ketanest, and add 5.5 mL of saline solution (0.9%).For complete anesthesia, inject intraperitoneally 10 μL/g body weight | ||
| Rompun (20 mg/ml Xylazine) | Bayer AG | ||
| Ketanest (25mg/ml Esketamine) | Pfizer Pharma GmbH | 647028001E | |
| BD Venflon 18GA (1,2x45mm, 80ml/min) | BD Biosciences | 391457 | |
| BD Venflon 16GA (1,7x45mm, 180ml/min) | BD Biosciences | 391455 | |
| BD Venflon 14GA (2,0x45mm, 270ml/min) | BD Biosciences | 391456 | |
| Catgut Polyester 4/0 white, non absorbable | Catgut GmbH | 17218113 | |
| Mariderm black 7/0, non absorbable | Catgut GmbH | 18104900 |
References
- Maier, S., Traeger, T., Entleutner, M., Westerholt, A., Kleist, B., Huser, N., Holzmann, B., Stier, A., Pfeffer, K., Heidecke, C. D. Cecal ligation and puncture versus colon ascendens stent peritonitis: two distinct animal models for polymicrobial sepsis. Shock. 21, 505-511 (2004).
- Bougaki, M., Searles, R. J., Kida, K., Yu, J. D. e, Buys, E. S., Ichinose, F. NOS3 protects against systemic inflammation and myocardial dysfunction in murine polymicrobial sepsis. Shock. , (2009).
- Buras, J. A., Holzmann, B., Sitkovsky, M. Animal models of sepsis: setting the stage. Nat Rev Drug Discov. 4, 854-865 (2005).
- Busse, M., Traeger, T., Potschke, C., Billing, A., Dummer, A., Friebe, E., Kiank, C., Grunwald, U., Jack, R. S., Schutt, C., Heidecke, C. D., Maier, S., Broker, B. M. Detrimental role for CD4+ T lymphocytes in murine diffuse peritonitis due to inhibition of local bacterial elimination. Gut. 57, 188-195 (2008).
- Daubeuf, B., Mathison, J., Spiller, S., Hugues, S., Herren, S., Ferlin, W., Kosco-Vilbois, M., Wagner, H., Kirschning, C. J., Ulevitch, R., Elson, G. TLR4/MD-2 monoclonal antibody therapy affords protection in experimental models of septic shock. J Immunol. 179, 6107-6114 (2007).
- Entleutner, M., Traeger, T., Westerholt, A., Holzmann, B., Stier, A., Pfeffer, K., Maier, S., Heidecke, C. D. Impact of interleukin-12, oxidative burst, and iNOS on the survival of murine fecal peritonitis. Int J Colorectal Dis. 21, 64-70 (2006).
- Kerschen, E. J., Fernandez, J. A., Cooley, B. C., Yang, X. V., Sood, R., Mosnier, L. O., Castellino, F. J., Mackman, N., Griffin, J. H., Weiler, H. Endotoxemia and sepsis mortality reduction by non-anticoagulant activated protein. C. J Exp Med. 204, 2439-2448 (2007).
- Kiank, C., Koerner, P., Kessler, W., Traeger, T., Maier, S., Heidecke, C. D., Schuett, C. Seasonal variations in inflammatory responses to sepsis and stress in mice. Crit Care Med. 35, 2352-2358 (2007).
- Lustig, M. K., Bac, V. H., Pavlovic, D., Maier, S., Grundling, M., Grisk, O., Wendt, M., Heidecke, C. D., Lehmann, C. Colon ascendens stent peritonitis--a model of sepsis adopted to the rat: physiological, microcirculatory and laboratory changes. Shock. 28, 59-64 (2007).
- Traeger, T., Kessler, W., Assfalg, V., Cziupka, K., Koerner, P., Dassow, C., Breitbach, K., Mikulcak, M., Steinmetz, I., Pfeffer, K., Heidecke, C. D., Maier, S. Detrimental role of CC chemokine receptor 4 in murine polymicrobial sepsis. Infect Immun. 76, 5285-5293 (2008).
- Traeger, T., Kessler, W., Hilpert, A., Mikulcak, M., Entleutner, M., Koerner, P., Westerholt, A., Cziupka, K., Rooijen, N. van, Heidecke, C. D., Maier, S. Selective depletion of alveolar macrophages in polymicrobial sepsis increases lung injury, bacterial load and mortality but does not affect cytokine release. Respiration. 77, 203-213 (2009).
- Traeger, T., Mikulcak, M., Eipel, C., Abshagen, K., Diedrich, S., Heidecke, C. D., Maier, S., Vollmar, B. Kupffer cell depletion reduces hepatic inflammation and apoptosis but decreases survival in abdominal sepsis. Eur J Gastroenterol Hepatol. , (2010).
- Weighardt, H., Kaiser-Moore, S., Schlautkotter, S., Rossmann-Bloeck, T., Schleicher, U., Bogdan, C., Holzmann, B. Type I IFN modulates host defense and late hyperinflammation in septic peritonitis. J Immunol. 177, 5623-5630 (2006).
- Zantl, N., Uebe, A., Neumann, B., Wagner, H., Siewert, J. R., Holzmann, B., Heidecke, C. D., Pfeffer, K. Essential role of gamma interferon in survival of colon ascendens stent peritonitis, a novel murine model of abdominal sepsis. Infect Immun. 66, 2300-2309 (1998).
