Qui, descriviamo un protocollo per l'isolamento e la coltura di cellule murine endoteliali polmonari. Questo metodo comprende meccanico e dissociazione enzimatica tessuto polmonare e una 2-step processo di purificazione con anti-PECAM-1 e anti-ICAM-2 anticorpi coniugati a sfere magnetiche, che produce una popolazione pura di cellule endoteliali di origine per lo più microvascolare.
Le cellule endoteliali forniscono un utile modello di ricerca in molte aree della biologia vascolare. Fin dal suo primo isolamento 1, cellule endoteliali della vena ombelicale (HUVECs) hanno dimostrato di essere comodo, facile da ottenere e cultura e, quindi, sono le cellule più ampiamente studiato endoteliali. Tuttavia, per la ricerca si è focalizzata sui processi come gli altri angiogenesi, permeabilità o molti, cellule endoteliali (EC) sono un modello molto più fisiologicamente rilevanti per lo studio 2. Inoltre, EC isolate da topi knockout per fornire un utile strumento per l'analisi ex-vivo di funzione della proteina. Diversi approcci per isolare e microvascolare cultura EC di diversa provenienza sono stati segnalati fino ad oggi 3-7, ma consistente isolamento e la cultura della pura ECS è ancora un grave problema tecnico in molti laboratori. Qui, forniamo un passo-passo protocollo su un metodo affidabile e relativamente semplice di isolare e coltura delle cellule endoteliali del polmone del mouse (MLECs). In questo approccio, tessuto polmonare ottenuti da 6 – a 8 giorni di cuccioli di età è prima tagliato a pezzi, digerito con collagenasi / dispasi (C / D) la soluzione e disperse meccanicamente in cella singola sospensione. MLECS sono purificati dalla sospensione cellulare tramite selezione positiva con l'anti-PECAM-1 coniugato a Dynabeads utilizzando un concentratore di particelle magnetiche (MPC). Tali cellule purificate sono coltivati su gelatina rivestita coltura tissutale (TC) piatti fino a diventare confluenti. A quel punto, le cellule sono ulteriormente purificato con Dynabeads accoppiato ad anti-ICAM-2 anticorpi. MLECs ottenuti con questo protocollo mostra un fenotipo ciottoli, come visualizzato in contrasto di fase microscopia ottica, e il loro fenotipo endoteliale è stata confermata con analisi FACS con anti-VE-caderina 8 e anti-VEGFR2 9 anticorpi e colorazione di immunofluorescenza di VE-caderina. Nelle nostre mani, questa procedura in due fasi isolamento in modo coerente e affidabile produce una popolazione pura di MLECs, che può essere ulteriormente coltivate. Questo metodo permetterà ai ricercatori di sfruttare il crescente numero di topi transgenici e knockout per correlare direttamente studi in vivo con i risultati di esperimenti in vitro eseguiti su MLECs isolato, contribuendo così a svelare i meccanismi molecolari del fenotipo vascolare osservata in vivo.
Microvascolari EC hanno dimostrato di essere un modello utile in molte aree della biologia vascolare e si crede di essere più fisiologicamente rilevanti per lo studio (angiogenesi ad esempio) che ampiamente studiato HUVECs 3. In precedenza, è stato riportato che microvascolare EC possono essere ottenute da reni, cuore, tessuto adiposo della pelle, della retina, del cervello, i gliomi, ma anche polmone 2, 4-7, 10, 11. Tuttavia, un metodo coerente e affidabile per l'isolamento di microvascolare ECS è ancora necessaria. La procedura qui presentata è una modifica di un protocollo precedentemente pubblicato 2; si differenzia dalla maggior parte delle procedure pubblicate in quanto utilizza cuccioli invece di animali adulti. Questo è fondamentale per il successo isolamento di cellule da giovani animali hanno un potenziale di proliferazione maggiore e culture deriva dal loro tessuti tendono a produrre un numero maggiore di cellule. Una settimana di vita gli animali sembrano essere ottimali, ma più giovani topi (giorno-vecchio 4) può anche essere usato. Inoltre, i numeri più alti o più bassi di cuccioli può essere utilizzata, se necessario, in quanto siamo riusciti a isolare MLECs da un cucciolo. Tuttavia, mentre la scala verso l'alto o verso il basso il processo di isolamento, placcatura densità cellulare deve rimanere invariato, in quanto questo è anche fondamentale per la proliferazione cellulare. Il 2-step del processo di purificazione MLECs utilizzando biglie magnetiche coniugate prima anti-PECAM-1 e di anti-ICAM-2 anticorpi è molto più efficiente ad ottenere puro culture CE rispetto alla precedentemente descritte passo-passo le procedure di purificazione. Questo protocollo elimina la necessità di utilizzare tecniche manuali molto laborioso, centrifugazione gradiente e FACS meno efficiente di smistamento per le cellule scartando contaminanti, come i fibroblasti, cellule del sangue e cellule muscolari lisce. La popolazione risultante MLEC può essere utilizzato per l'analisi in vitro delle risposte angiogenici, permeabilità vascolare e la trasmigrazione dei leucociti, la guarigione della ferita e l'analisi biochimica delle vie di segnalazione. Se necessario, MLECs può essere placcato su superfici diverse, come coprioggetto fibronectina o gelatina rivestite di immunofluorescenza o array di elettrodi per la trans-endoteliale resistenza (TER) misurazioni. Risultati ottenuti possono essere direttamente confrontati con i fenotipi osservate in vivo, che è particolarmente importante nel contesto del crescente numero di eliminazione diretta e le linee di topi transgenici. Il successo di questo metodo per l'analisi in vitro dei meccanismi cellulari alla base difetti osservate in vivo, è già stato presentato 12.
The authors have nothing to disclose.
Questa ricerca è stata sostenuta in parte dalla American Heart Association concedere 0950118G.to MC-W.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Spring scissors | Fine Science Tools | 15032-13 | ||
forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | ||
14G cannula | Fisher | 1482516N | ||
20 ml syringe | BD | 309661 | ||
BSA | Sigma-Aldrich | A7030-100G | ||
anti-rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110.35 | ||
Magnetic Particle Concentrator (MPC) | Invitrogen | 123-21D | ||
anti-mouse PECAM-1 antibody (CD-31) | BD Pharmingen | 553369 | ||
anti-mouse ICAM-2 antibody (CD-102) | BD Pharmingen | 553326 | ||
Collagenase/Dispase (C/D) | Roche Applied Science | 11097113001 | 100mg/ml stock solution can be prepared and stored at -20°C | |
DMEM | Cellgro Mediatech | 10-013-CV | ||
Bovine Skin Gelatin | Sigma-Aldrich | #G9391-100G | ||
Vasculife EnGS-Mv complete kit (VL) | Lifeline Cell Technology | LL0004 | ||
0.05% Trypsin/EDTA | Mediatech | 25-052-CI | ||
Cell strainer 70 μm nylon | Falcon | 352350 | ||
tissue culture flask 75 cm2 | TPP | 90076 |