Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Isolierung und Kultivierung von murinen pulmonalen Endothelzellen. Dieses Verfahren umfasst mechanische und enzymatische Lungengewebe Dissoziation sowie eine 2-Schritt-Reinigungsverfahren mit anti-PECAM-1 und anti-ICAM-2-Antikörper, konjugiert an magnetische Kügelchen, die eine reine Endothelzellen Bevölkerung meist mikrovaskuläre Herkunft produziert.
Endothelzellen stellen einen nützlichen Forschung Modell in vielen Bereichen der vaskulären Biologie. Seit der ersten Isolierung 1, haben menschliche Nabelschnur-Endothelzellen (HUVECs) gezeigt werden, bequem, leicht zu beschaffen und Kultur, und damit sind die am häufigsten untersuchten Endothelzellen. Doch für die Forschung an Prozessen wie Angiogenese, Permeabilität oder viele andere konzentriert, sind mikrovaskuläre Endothelzellen (ECs) eine viel physiologisch relevante Modell-2-Studie. Darüber hinaus ECs isoliert von Knockout-Mäusen ein nützliches Werkzeug für die Analyse von Protein-Funktion ex vivo. Verschiedene Ansätze zu isolieren und Kultur mikrovaskulären ECs unterschiedlicher Herkunft sind bisher 3-7 berichtet worden, aber konsequente Isolierung und Kultivierung von reinem ECs immer noch ein großes technisches Problem in vielen Laboratorien. Hier bieten wir Ihnen eine Schritt-für-Schritt-Protokoll auf eine zuverlässige und relativ einfache Methode zur Isolierung und Kultivierung Mauslunge Endothelzellen (MLECs). Bei diesem Ansatz Lungengewebe von 6 erhalten – bis 8-Tage alte Jungtiere zunächst in Stücke geschnitten wird, verdaut mit Kollagenase / Dispase (C / D)-Lösung und verteilt mechanisch in den Single-Zellsuspension. MLECS aus Zellsuspension unter Verwendung einer positiven Selektion mit anti-PECAM-1-Antikörper, konjugiert mit Dynabeads mit Hilfe eines Magnetic Particle Concentrator (MPC). Solche gereinigten Zellen auf Gelatine-beschichteten Gewebekultur (TC) Schalen kultiviert, bis sie konfluent geworden. Zu diesem Zeitpunkt werden die Zellen weiter gereinigt mit Dynabeads gekoppelt anti-ICAM-2 Antikörpers. MLECs mit diesem Protokoll erhaltenen weisen einen Pflasterstein Phänotyp, wie visualisiert Phasenkontrast-Lichtmikroskopie und ihre endothelialen Phänotyp bestätigt wurde mittels FACS-Analyse mit anti-VE-Cadherin-8 und anti-VEGFR2 9 Antikörper und Immunfluoreszenzfärbung von VE-Cadherin. In unseren Händen, das Zwei-Schritt-Isolierung Verfahren konsistent und zuverlässig liefert eine reine Population von MLECs, die weiter kultiviert werden können. Diese Methode ermöglicht es Forschern, die Vorteile der wachsenden Zahl von Knockout-und transgenen Mäusen direkt in vivo Studien korrelieren mit den Ergebnissen von in vitro Experimenten an isolierten MLECs durchgeführt zu nehmen und so dazu beitragen, die molekularen Mechanismen der vaskulären Phänotypen in vivo beobachtet zu offenbaren.
Mikrovaskulären ECs haben sich als nützliches Modell in vielen Bereichen der vaskulären Biologie und sind vermutlich mehrere physiologisch relevanten Studie (zB Angiogenese) als weitgehend untersucht HUVECs 3. Zuvor wurde berichtet, dass mikrovaskuläre Endothelzellen aus Niere, Herz, Haut, Netzhaut, Gehirn, Gliome, Fettgewebe und auch Lunge 2, 4-7, 10, 11 erzielt werden kann. Allerdings ist eine konsistente und zuverlässige Methode zur Isolierung von mikrovaskulären ECs weiterhin erforderlich. Das hier vorgestellte Verfahren ist eine Modifikation eines bereits veröffentlichten Protokoll 2, es unterscheidet sich von den meisten veröffentlichten Verfahren durch die Nutzung der Welpen anstelle von erwachsenen Tieren. Dies ist entscheidend für die Isolierung Erfolg als Zellen von jungen Tieren eine höhere Verbreitung Potential haben und Kulturen aus ihren Geweben stammen in der Regel höhere Anzahl der Zellen zu erhalten. Eine Woche alten Tiere scheinen optimal zu sein, aber jüngere Mäuse (4 Tage alten) können ebenfalls verwendet werden. Auch können höhere oder niedrigere Anzahl von Jungtieren bei Bedarf verwendet werden, wie wir schon bei der Isolierung MLECs von einem Welpen haben erfolgreich. Doch während die Skalierung nach oben oder unten die Isolierung Prozess muss Zelle Plattierungsdichte bleiben unverändert, wie dies auch von entscheidender Bedeutung für die Zellproliferation. Die 2-Schritt-Reinigungsverfahren MLECs mit magnetischen Beads konjugiert erste anti-PECAM-1 und als anti-ICAM-2-Antikörper ist viel effizienter bei der Gewinnung von reinem EG Kulturen als die zuvor beschriebenen einstufigen Reinigungsverfahren. Dieses Protokoll entfällt die Notwendigkeit, sehr aufwändige manuelle Techniken, Gradientenzentrifugation und weniger effizient FACS-Sortierung für das Verwerfen kontaminierenden Zellen wie Fibroblasten, Blutzellen und Zellen der glatten Muskulatur zu verwenden. Die daraus resultierende MLEC Bevölkerung kann für die in vitro Analyse der angiogenen Reaktion, Gefäßpermeabilität und Leukozyten-Transmigration, Wundheilung sowie biochemische Untersuchung von Signalwegen verwendet werden. Falls erforderlich, kann MLECs auf verschiedenen Oberflächen wie Fibronektin oder Gelatine-beschichtete Deckgläser für Immunfluoreszenz oder Elektroden-Arrays für die trans-endothelialen Widerstand (TER) Messungen beschichtet werden. Die erhaltenen Ergebnisse können direkt an die Phänotypen in vivo, was besonders wichtig ist im Zusammenhang mit der wachsenden Zahl von Knockout und transgene Mauslinien beobachtet verglichen werden. Die erfolgreiche Umsetzung dieses Verfahrens zur in vitro Analyse von zellulären Mechanismen, die Mängel in vivo zu beobachten, wurde bereits 12 dargestellt.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde teilweise durch American Heart Association gewähren 0950118G.to MC-W unterstützt.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Spring scissors | Fine Science Tools | 15032-13 | ||
forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | ||
14G cannula | Fisher | 1482516N | ||
20 ml syringe | BD | 309661 | ||
BSA | Sigma-Aldrich | A7030-100G | ||
anti-rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110.35 | ||
Magnetic Particle Concentrator (MPC) | Invitrogen | 123-21D | ||
anti-mouse PECAM-1 antibody (CD-31) | BD Pharmingen | 553369 | ||
anti-mouse ICAM-2 antibody (CD-102) | BD Pharmingen | 553326 | ||
Collagenase/Dispase (C/D) | Roche Applied Science | 11097113001 | 100mg/ml stock solution can be prepared and stored at -20°C | |
DMEM | Cellgro Mediatech | 10-013-CV | ||
Bovine Skin Gelatin | Sigma-Aldrich | #G9391-100G | ||
Vasculife EnGS-Mv complete kit (VL) | Lifeline Cell Technology | LL0004 | ||
0.05% Trypsin/EDTA | Mediatech | 25-052-CI | ||
Cell strainer 70 μm nylon | Falcon | 352350 | ||
tissue culture flask 75 cm2 | TPP | 90076 |