כאן אנו מתארים פרוטוקול לבידוד והתרבות של Murine לתאי אנדותל ריאתי. שיטה זו כוללת מכונאי דיסוציאציה האנזימטית רקמת הריאות, כמו גם תהליך צעד 2-טיהור באמצעות אנטי PECAM-1 ואנטי ICAM-2 נוגדנים מצומדות כדי חרוזים מגנטיים, אשר מייצר אוכלוסיה טהור תא האנדותל של כלי הדם בעיקר מקור.
לתאי אנדותל לספק מודל מחקר שימושי בתחומים רבים של הביולוגיה וסקולרית. מאז הבידוד הראשון שלה 1, אדם וריד הטבור לתאי אנדותל (HUVECs) הראו להיות נוח, קל להשיג והתרבות, ובכך הם לתאי אנדותל ביותר למד נרחב. עם זאת, המחקר התמקד בתהליכים כמו אחרים, אנגיוגנזה חדירות או רבים, לתאי אנדותל כלי הדם (ECS) הם מודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית הרבה יותר ללמוד 2. יתר על כן, ECS מבודד עכברים knockout לספק כלי יעיל לניתוח של vivo תפקוד החלבון לשעבר. מספר גישות לבודד כלי הדם תרבות ECS ממוצא שונה דווחו עד כה 3-7, אבל הבידוד תרבות עקבית של טהור ECS עדיין בעיה טכנית גדולה במעבדות רבות. כאן, אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד על שיטה אמינה פשוטה יחסית של בידוד ועכבר culturing הריאות לתאי אנדותל (MLECs). בגישה זו, רקמת הריאה המתקבל 6 – עד היום-8 גורים הישן החתך הראשון לחתיכות, מעוכל עם collagenase / dispase (C / D) פתרון והתפזרו מכני לתוך ההשעיה תא בודד. MLECS הם מטוהרים מן ההשעיה התא באמצעות סלקציה חיובית עם נוגדן אנטי PECAM-1 מצומדות כדי Dynabeads מרוכז באמצעות חלקיקים מגנטיים (MPC). תאים אלה בתרבית מטוהרים על תרבות ג'לטין מצופה רקמה (TC) מנות עד שהם הופכים ומחוברות. בשלב זה, התאים עוד מטוהרים באמצעות Dynabeads מצמידים את הנוגדן אנטי ICAM 2. MLECs שהושגו עם פרוטוקול זה תערוכה פנוטיפ המרוצף, דמיינו כפי מיקרוסקופיה שלב לעומת האור, פנוטיפ האנדותל שלהם אושרה באמצעות ניתוח FACS עם אנטי VE-cadherin 8 ואנטי VEGFR2 9 נוגדנים מכתים immunofluorescent של cadherin-VE. בידיים שלנו, זה הליך בן שני שלבים בידוד עקבית ומהימנה התשואות אוכלוסייה טהורה של MLECs, אשר יכול להיות מתורבת יותר. שיטה זו תאפשר לחוקרים לנצל מספר גדל והולך של בנוקאאוט ו העכברים הטרנסגניים ישירות לתאם במחקרים vivo עם תוצאות של ניסויים במבחנה שבוצעו על MLECs מבודד ובכך לסייע לחשוף את המנגנונים המולקולריים של פנוטיפים כלי דם נצפתה in vivo.
כלי הדם ECS הוכיחו להיות מודל שימושי בתחומים רבים של הביולוגיה כלי הדם הם האמינו להיות יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ללמוד (אנגיוגנזה למשל) מאשר HUVECs למד נרחב 3. בעבר, זה כבר דיווחו כי כלי הדם ECS ניתן להשיג, כליות רקמת לב, שומן, עור הרשתית, מוח, גליומות, וגם ריאה 2, 4-7, 10, 11. עם זאת, שיטה עקבית ואמינה הבידוד של כלי הדם ECS עדיין נדרשת. הנוהל המובא כאן הוא שינוי של הפרוטוקול שפורסם בעבר 2, זה שונה נהלים פרסם ביותר כי היא משתמשת במקום גורים של בעלי חיים מבוגרים. זה חיוני להצלחת בידוד כמו תאים מבעלי חיים צעירים בעלי פוטנציאל גבוה יותר ריבוי תרבויות שמקורם ברקמות שלהם נוטים להניב מספר גבוה יותר של תאים. אחת החיות בשבוע הישן נראה אופטימלי, אבל עכברים צעירים (4 בן יומו) יכול לשמש גם. כמו כן, מספר גבוה או נמוך של הגורים יכולה לשמש אם נדרש, כפי שאנו הצליחו לבודד MLECs מאחד הסיירים. עם זאת, בעוד דרוג כלפי מעלה או מטה את תהליך הבידוד, ציפוי צפיפות התאים חייב להישאר ללא שינוי, כמו זה גם קריטי עבור התפשטות תאים. תהליך צעד 2-טיהור MLECs באמצעות חרוזים מגנטיים מצומדות הראשון נגד PECAM-1 ו מאשר אנטי ICAM-2 נוגדנים הוא הרבה יותר יעיל בהשגת טהור תרבויות EC מאשר אחד צעד את התהליכים שתוארו לעיל טיהור. פרוטוקול זה מבטל את הצורך להשתמש בטכניקות ידני מייגע מאוד, צנטריפוגה שיפוע FACS פחות יעיל מיון עבור תאים השלכת מזהמים כגון fibroblasts, כדוריות דם ותאי שריר חלק. האוכלוסייה MLEC וכתוצאה מכך ניתן להשתמש בניתוח מבחנה של תגובות angiogenic, חדירות כלי הדם גלגול ליקוציט, ריפוי פצעים, כמו גם ניתוח ביוכימי של מסלולי איתות. במידת הצורך, ניתן MLECs מצופה על גבי משטחים שונים כגון coverslips פיברונקטין או ג'לטין מצופה עבור מערכים immunofluorescence או אלקטרודה עבור טרנס האנדותל (TER) מדידות של התנגדות. התוצאות המתקבלות ניתן להשוות ישירות פנוטיפים נצפתה in vivo, אשר חשוב במיוחד בהקשר של מספר גדל והולך של נוקאאוט קווי עכבר מהונדס. יישום מוצלח של השיטה עבור בניתוח מבחנה של מנגנוני הסלולר הבסיסית פגמים נצפתה in vivo, כבר הציגה 12.
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה מומן בחלקו על ידי איגוד הלב האמריקני להעניק 0950118G.to MC-W.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Spring scissors | Fine Science Tools | 15032-13 | ||
forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | ||
14G cannula | Fisher | 1482516N | ||
20 ml syringe | BD | 309661 | ||
BSA | Sigma-Aldrich | A7030-100G | ||
anti-rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110.35 | ||
Magnetic Particle Concentrator (MPC) | Invitrogen | 123-21D | ||
anti-mouse PECAM-1 antibody (CD-31) | BD Pharmingen | 553369 | ||
anti-mouse ICAM-2 antibody (CD-102) | BD Pharmingen | 553326 | ||
Collagenase/Dispase (C/D) | Roche Applied Science | 11097113001 | 100mg/ml stock solution can be prepared and stored at -20°C | |
DMEM | Cellgro Mediatech | 10-013-CV | ||
Bovine Skin Gelatin | Sigma-Aldrich | #G9391-100G | ||
Vasculife EnGS-Mv complete kit (VL) | Lifeline Cell Technology | LL0004 | ||
0.05% Trypsin/EDTA | Mediatech | 25-052-CI | ||
Cell strainer 70 μm nylon | Falcon | 352350 | ||
tissue culture flask 75 cm2 | TPP | 90076 |