Aqui, nós descrevemos um protocolo para isolamento e cultura de células endoteliais pulmonares de camundongos. Este método compreende mecânico e dissociação enzimática do tecido pulmonar, bem como um processo de purificação passo 2, utilizando anti-PECAM-1 e anti-ICAM-2 anticorpos conjugados com esferas magnéticas, que produz uma população de células endoteliais pura de origem principalmente microvascular.
Células endoteliais fornecer um modelo de pesquisa útil em muitas áreas da biologia vascular. Desde o seu primeiro isolamento 1, as células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) têm se mostrado conveniente, fácil de obter e cultura, e, portanto, são as células mais amplamente estudada endoteliais. No entanto, para a pesquisa focada em processos como os outros permeabilidade a angiogênese, ou muitos, células endoteliais microvasculares (ECs) são um modelo muito mais fisiologicamente relevante para o estudo 2. Além disso, a ECS isolados de camundongos knockout fornecer uma ferramenta útil para a análise de proteínas ex vivo função. Várias abordagens para isolar e microvascular cultura CEPs de origem diferentes foram relatados até agora 3-7, mas o isolamento consistente e cultura de pura CEPs ainda é um grande problema técnico em muitos laboratórios. Aqui, nós fornecemos um protocolo passo a passo sobre um método confiável e relativamente simples de isolar e cultivar células endoteliais pulmonares do rato (MLECs). Nesta abordagem, o tecido pulmonar obtido a partir de 6 – a 8 dias de idade os filhotes é o primeiro corte em pedaços, digeridos com colagenase / dispase (C / D) de soluções e dispersas mecanicamente em uma única célula de suspensão. MLECS são purificados a partir de suspensão celular usando a seleção positiva com anti-PECAM-1 anticorpo conjugado a Dynabeads usando um concentrador de Partícula Magnética (MPC). Tais células purificadas são cultivadas em gelatina revestidos de cultura de tecidos (CT) pratos até que eles se tornam confluentes. Nesse ponto, as células são mais purificado utilizando Dynabeads acoplado a anti-ICAM-2 de anticorpos. MLECs obtidas com este protocolo exibem um fenótipo de paralelepípedos, como visualizado por contraste de fase microscopia de luz, e seu fenótipo endotelial foi confirmada através da análise FACS com anti-VE-caderina 8 e anti-VEGFR2 9 anticorpos e coloração de imunofluorescência de VE caderina. Em nossas mãos, este procedimento de isolamento de duas etapas de forma consistente e confiável rende uma população pura de MLECs, que pode ser mais culta. Este método vai permitir aos investigadores para aproveitar o crescente número de knockout e camundongos transgênicos para correlacionar diretamente os estudos in vivo com os resultados de experimentos in vitro realizados em MLECs isolados e, assim, ajudar a revelar os mecanismos moleculares dos fenótipos vasculares observados in vivo.
Microvascular ECs têm provado ser um modelo útil em muitas áreas da biologia vascular e acredita-se ser mais fisiologicamente relevante para o estudo (angiogênese, por exemplo) do que HUVECs amplamente estudada 3. Anteriormente, foi relatado que microvascular ECs podem ser obtidas no rim, coração de tecido adiposo, pele, retina, cérebro, gliomas, e também de pulmão 2, 4-7, 10, 11. No entanto, um método consistente e confiável para isolamento de microvascular CEPs ainda é necessária. O procedimento apresentado aqui é uma modificação de um protocolo previamente publicado 2, que difere da maioria dos procedimentos publicados na medida em que usa filhotes ao invés de animais adultos. Isso é crucial para o sucesso de isolamento, como células de animais jovens têm um maior potencial de proliferação e culturas derivadas de seus tecidos tendem a produzir maior número de células. Uma semana de idade os animais parecem ser o ideal, mas os ratos mais jovens (4 dias de idade) também pode ser usado. Além disso, os números mais altos ou mais baixos de filhotes pode ser usado se for necessário, como temos sido bem sucedidos em isolar MLECs de um filhote de cachorro. No entanto, enquanto scaling cima ou para baixo o processo de isolamento, a densidade de células de revestimento deve permanecer inalterada, já que esta é também crítico para a proliferação celular. O processo de purificação passo 2 de MLECs usando esferas magnéticas conjugadas primeiro a anti-PECAM-1 e do anti-ICAM-2 anticorpos é muito mais eficiente para a obtenção de culturas puras CE que o descrito anteriormente procedimentos única etapa de purificação. Este protocolo elimina a necessidade de usar técnicas manuais muito trabalhoso, a centrifugação de gradiente e FACS menos eficiente de classificação para as células descartando a contaminação, como fibroblastos, células do sangue e células musculares lisas. A população resultando MLEC pode ser usado para análise in vitro de respostas angiogênico, permeabilidade vascular e transmigração de leucócitos, cicatrização de feridas, bem como análise bioquímica de vias de sinalização. Se necessário, pode ser MLECs semeadas em diferentes superfícies, como lamínulas fibronectina ou gelatina revestido de imunofluorescência ou eletrodo matrizes de trans-endotelial resistência (TER) medições. Resultados obtidos podem ser diretamente comparado com os fenótipos observados in vivo, que é especialmente importante no contexto do crescente número de knockout e linhas de ratinhos transgénicos. Implementação bem sucedida deste método para análise in vitro de mecanismos celulares subjacentes defeitos observados in vivo, já foi apresentada 12.
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa foi suportada em parte pela American Heart Association conceder 0950118G.to MC-W.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Spring scissors | Fine Science Tools | 15032-13 | ||
forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | ||
14G cannula | Fisher | 1482516N | ||
20 ml syringe | BD | 309661 | ||
BSA | Sigma-Aldrich | A7030-100G | ||
anti-rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110.35 | ||
Magnetic Particle Concentrator (MPC) | Invitrogen | 123-21D | ||
anti-mouse PECAM-1 antibody (CD-31) | BD Pharmingen | 553369 | ||
anti-mouse ICAM-2 antibody (CD-102) | BD Pharmingen | 553326 | ||
Collagenase/Dispase (C/D) | Roche Applied Science | 11097113001 | 100mg/ml stock solution can be prepared and stored at -20°C | |
DMEM | Cellgro Mediatech | 10-013-CV | ||
Bovine Skin Gelatin | Sigma-Aldrich | #G9391-100G | ||
Vasculife EnGS-Mv complete kit (VL) | Lifeline Cell Technology | LL0004 | ||
0.05% Trypsin/EDTA | Mediatech | 25-052-CI | ||
Cell strainer 70 μm nylon | Falcon | 352350 | ||
tissue culture flask 75 cm2 | TPP | 90076 |