Enregistrements physiologiques des NMJs rendement élevé et faible sur le muscle extenseur écrevisses jambe

Summary

Cet article montre comment effectuer des enregistrements électrophysiologiques des réponses synaptiques sur le muscle extenseur de la jambe de marche d'une écrevisse et comment les terminaisons nerveuses sont visualisés à montrer les différences morphologiques de brut à haute et basse-sortie terminaisons nerveuses.

Abstract

Nous expliquons en détail comment exposer et de conduite des enregistrements électrophysiologiques des réponses synaptiques de haut (phasique) et faible (tonique) neurones moteurs innervant la sortie du muscle extenseur de la jambe de marche d'une écrevisse. Différences distinctes sont présentes dans la physiologie et la morphologie des terminaisons nerveuses phasique et tonique. L'axone tonique contient beaucoup plus de mitochondries, ce qui lui permet de prendre un colorant vital plus intensément que l'axone phasique. Les bornes tonique ont varicosités, et le terminal phasique est filiforme. Les bornes tonique sont faibles dans l'efficacité synaptique mais montrent dramatiques réponses facilitée. En revanche, les bornes phasiques sont élevés dans l'efficacité quantique, mais montrent la dépression synaptique à la stimulation à haute fréquence. La sortie quantique est mesuré avec une électrode macropatch focale placé directement sur les terminaisons nerveuses visualisées. Les deux terminaux phasique et tonique innervent les mêmes fibres musculaires, ce qui suggère que les différences inhérentes dans les neurones, plutôt que de réactions différentielles rétrogrades du muscle, tenir compte de la différenciation morphologique et physiologique.

Protocol

1) Introduction

Les neurones moteurs de communiquer avec une fibre musculaire au niveau des synapses qui sont désignées collectivement comme une jonction neuromusculaire (JNM). NMJs peut être consulté facilement dans la plupart des préparations musculaires écrevisses. Beaucoup de NMJs écrevisses démontrer la non-dopage potentiels postsynaptiques excitateurs (PPSE) semblables à des signaux électriques générés dans gradué dendrites postsynaptiques dans le SNC des mammifères ou des réponses sous le seuil mentionné dans NMJs vertébrés (Wiersma & Van Harreveld, 1938; Katz & Kuffler, 1946) . Le NMJs écrevisses peuvent servir de modèles fondamentaux synaptique à fournir un aperçu général de la transmission synaptique et la différenciation synaptique.

Généralement, les unités motrices réglementer certains aspects du comportement des animaux via le type de communication synaptique au NMJs et les propriétés des muscles. Depuis la première observation de "rapide" et "lent" des contractions musculaires dans les crabes et les écrevisses rapprocher musculaire (Lucas, 1907, 1917), semblable différenciation musculaire contractile qui a été décrit dans d'autres types de muscles fléchisseurs comme les écrevisses abdominale (Kennedy & Takeda, 1965a , b) et extenseurs des membres (Van Harreveld & Wiersma, 1936). "Rapide" contractions initier des réponses rapides. Par exemple, le flip queue d'écrevisse est un comportement rapide. "Slow" contractions de maintenir des mouvements lents et aider à maintenir la posture (Bradacs et al., 1997). Correspondant à "rapide" et "lent" des contractions musculaires, «phasique / haut rendement" et "sortie tonique / faible» sont largement utilisés pour décrire les neurones moteurs. La différence de taux et le moment de la contraction musculaire est en partie liée à des différences dans la structure synaptique présynaptique et de la force synaptique (King et al., 1996). Protéines myofibrillaires isoforme expression est également important dans les différences de contraction, mais dans des préparations comme celle du muscle extenseur de la jambe, dans lequel une fibre donnée est innervée par les deux types de neurones moteurs, l'accent est mis sur les différences synaptiques des terminaux, car les bornes part la cellule cible mêmes (Mykles et al., 2002). Une étude antérieure a examiné les deux axones moteurs excitateurs de l'extenseurs de la jambe et a décrit les phénotypes phasique et tonique (Bradacs et al., 1997). Dans ce rapport, nous démontrons comment effectuer la dissection et d'obtenir des enregistrements afin que d'autres peuvent en outre d'étudier les propriétés de la différenciation synaptique de ces terminaisons nerveuses.

Examiné à la microscopie électronique à transmission, différentes séries de coupes obtenues à partir de la tonique et phasique terminaux sur le muscle extenseur écrevisses jambe a révélé que les terminaux toniques vésicules contiennent plus que les terminaux RRP phasique; les mitochondries sont plus répandus dans les neurones toniques, et les synapses sur les terminaux sont phasique plus complexes que ceux sur les synapses à faible rendement, car elles contiennent plusieurs zones actives, avec un espacement varié (Miller et al, 2002; Johnstone et al, 2008;. King et al, 1996;.. Bradacs et al, 1997). Les terminaux à faible rendement toniques sont également plus sensibles à l'amélioration de la transmission synaptique à la sérotonine neuromodulateur (5-HT) que sont les terminaux phasique (Cooper et al., 2003).

Le fait que la tonique et phasique JNM sont présents sur la fibre musculaire même il est plus facile d'évaluer les différences présynaptique sur une fibre musculaire donnée et pour répondre aux questions de la fatigue musculaire, la dépression synaptique et la diaphonie synaptique. Diverses questions restent à régler dans cette préparation, comme s'il ya des différences dans la densité des récepteurs post-synaptiques et les types de récepteurs du glutamate dans les cibles postsynaptiques de la tonique et phasique bornes, mais une meilleure compréhension des différences fondamentales dans l'anatomie et la physiologie de ces deux unités de moteur d'aide à bâtir une base de connaissances plus profondes. L'espoir est que les principes fondamentaux appris dans cette préparation synaptique sera applicable à d'autres synapses dans diverses préparations et permettra d'améliorer les enquêtes futures dans ce modèle synaptique de l'écrevisse.

2) Méthodes

1. Toutes les expériences sont menées sur les jambes première ou la deuxième marche de l'écrevisse de taille moyenne (Procambarus clarkii). Les animaux sont logés individuellement dans des récipients en plastique avec l'eau oxygénée. La température de la salle des animaux est de l'ordre de 13 ° C-16 ° C. Les animaux sont nourris avec de la nourriture du poisson sec et l'eau a changé sur une base hebdomadaire.

   
   Figure 1: Schéma d'une jambe d'écrevisses à pied et les six segments distaux.

2. L'aspect distal de la jambe marcher dans une écrevisse est anatomiquement divisé en six segments (figure 1). Les extenseurs de la jambe est situé dans le meropodite, et le faisceau nerveux qui sera isolée est près de l'articulation meropodite ischiopodite. L'axone tonique ou phasique peut be sélective stimulée au besoin à des fins physiologiques, après ils sont exposés.
3. Cooper et Cooper (2009) décrit certains aspects de la dissection initiale, y compris des méthodes pour exposer l'excitateur du neurone moteur ouvre dans la région meropodite, mais leur description ne donne pas les soins nécessaires pour protéger le muscle extenseur de tout dommage, car il était ne sont pas nécessaires pour répondre à la préparation musculaire ouvreur. Afin de protéger l'extenseur, la jambe marchant première ou la seconde est retiré de l'écrevisse, la mesure de 6-10 cm de longueur du corps (Atchafalaya biologique Supply Co., Raceland, LA), en induisant l'animal pour automatiser le membre avec pincements énergiques distale du plan de fracture dans le segment ischiopodite. La jambe est placée sur le plateau de dissection avec le latéral (côté extérieur) face au spectateur. La jambe est tournée autour jusqu'à ce que le spectateur peut être sûr à l'extérieur (côté latéral) est orientée vers le haut sur la plaque de dissection, généralement avec le côté voûté au-dessus (figure 2). Placer la jambe sur un morceau de papier de soie, il est plus facile de tourner la préparation tout en faisant ces coupes.

   
   Figure 2: Le côté latéral du meropodite, habituellement du côté qui est arqué, est orientée vers le haut sur ​​la plaque de dissection ..

4. Avec un disjoncteur lame de scalpel et titulaire, une lame de rasoir est utilisé pour graver la cuticule jusqu'au simplement couper à travers dans le motif de la figure 3 pour le segment meropodite. Il est pris soin de ne pas couper trop loin sur la dorsale distale de couper ventrale par la commune meropodite-carpopodite.

   
   Figure 3: Le segment meropodite avec des lignes comme un modèle suggéré pour la gravure par la fenêtre de la cuticule.

   La préparation est placée dans une solution saline. Le plat doit avoir une dissection Sylgard (Dow Corning) revêtement sur le fond (1cm d'épaisseur). Le Sylgard est utilisée afin que les broches d'insectes peut être coincé dedans pour la tenue de la préparation encore. À ce stade, une épingle est coincé dans le milieu du segment carpopodite et dans la face dorsale du segment ischiopodite (figure 4). Des préparations disséquées sont baignés dans une solution saline écrevisses standard, modifiées de la solution Van Harreveld s (1936), ce qui est fait avec 205 NaCl; 5.3KCl; 13,5 CaCl _2; 2H ₂ O; 2,45 MgCl _2; 6H ₂ O; HEPES 5 et ajusté pour pH 7,4 (en mm).

   
   Figure 4: Le segment meropodite avec fenêtre découpée être soulevé. Notez l'emplacement des broches de dissection.

5. La cuticule est délicatement soulevé dans la région distale et les fibres musculaires sont coupés de la cuticule en faisant coups vers la base de la jambe. La cuticule peut être enlevé.
6. Le apodeme (tendon) est coupée au niveau du joint meropodite-carpopodite. Une broche est placée sur la surface interne du tendon fléchisseur de montrer d'où la coupe doit être faite (figure 5). Le tendon est alors pincé où il a été coupé avec une pince à épiler et le muscle fléchisseur retiré en le soulevant dans une direction caudale (figure 6), exposant le nerf principal et la jambe du muscle extenseur.

   
   Figure 5: Le apodeme du muscle fléchisseur est mis en évidence en le déplaçant de la fléchisseurs avec une épingle.

   
   Figure 6: Le apodeme du muscle fléchisseur est coupé et enlevé avec soin pour ne pas endommager le nerf jambe principale.

7. Le nerf principal est coupé la jambe à l'articulation meropodite-carpopodite et soigneusement tiré en arrière sur le muscle extenseur. La face médiale du muscle est utilisé dans cette étude. La séparation du nerf au muscle extenseur de la jambe du nerf principal peut être améliorée en tirant doucement sur le moignon distal du nerf jambe principale sur le côté de la préparation. Lorsque le nerf éplucher la jambe principale revenir sur les muscles extenseurs, les petites branches de l'axone peut être nécessaire de couper. Ce sont des branches de l'inhibition du neurone moteur du muscle extenseur. Le plus grand ensemble de bifurquer par le nerf principal, près de la jambe extrémité proximale du meropodite est le faisceau nerveux peu d'intérêt.

   
   Figure 7: Le nerf jambe principale est coupé et tiré vers l'arrière dans une direction proximale.

   Ce faisceau nerveux peut être vu avec coloration au bleu de méthylène (figure 8) ou avec 4-di-2-ASP colorant fluorescent (figure 9).

   
   Figure 8: Le muscle extenseur teinté au bleu de méthylène. Notez le branchement des axones et desdeux axones facilement visible dans le nerf. Les flèches rouges Danemark la piste nerveuse.

   
   Figure 9: Les axones des neurones moteurs teinté avec 4-di-2-ASP. L'axone tonique est plus brillamment visible en raison de l'augmentation du contenu mitochondrial.

   
   Figure 10A: terminaux individuels de neurones phasique et tonique colorés avec 4-di-2-ASP. Notez les varicosités sur les bornes de la nature tonique et mince de bornes phasique.

   
   Figure 10B-Tonic noté

   
   Figure 10C-phasique noté

3) profils physiologiques

1. Pour observer les potentiels excitateurs post-synaptiques (EPSP) des neurones tonique ou phasique, l'un des axones isolés dans le faisceau nerveux est stimulé par une électrode d'aspiration (figure 11) relié à un stimulateur Grass tout le potentiel intracellulaire dans le muscle sont surveillés (Johnstone et al., 2008). La stimulation à 70 Hz est appliquée à l'axone tonique dans le but de promouvoir une réponse facilitée pour les NMJs sortie faible, ou une seule impulsion (1 Hz) est appliquée à l'axone phasique afin d'obtenir RPEB importante de la production de haute NMJs comme le montre dans la figure 12. Les PPSE sont enregistrées à un ordinateur via une interface PowerLab/4s.

   
   Figure 11: électrode de stimulation placée sur un seul axone au sein du faisceau nerveux. Notez la ligne verte présentant les deux principaux axones.

   
   Figure 12: Potentiel postsynaptique (PPSE) des neurones tonique ou phasique obtenu par enregistrements intracellulaires.

2. Enquête dans la nature de facilitation synaptique et la dépression synaptique peut être approché par différents paradigmes expérimentaux avec la sortie de NMJs basse et haute. Facilitation de l'NMJs faible rendement dépend de la fréquence, comme indiqué pour les impulsions de 20 Hz, 40 et 60 de l'ordre de 20 stimuli (figure 13).

   
   Figure 13: EPSP en réponse à un train d'impulsions de stimulation donnée à trois fréquences différentes 20, 40 et 60 Hz dans une solution saline normale écrevisses.

3. Le taux de dépression synaptique à la fréquence de stimulation est également liée à la NMJs de sortie élevé. La figure 14 montre un processus continu de 5 Hz de la stimulation de la JNM déprimante de plus de 30 min. Avec une fréquence plus élevée de stimulation, la préparation pèsera plus rapidement (Bradacs et al., 1997).

   
   Figure 14: amplitude de l'EPSP de la réponse phasique pendant 5 Hz à la stimulation provoquer une dépression.

4) Les réponses Quantal

1. Une procédure similaire à celle décrite pour le muscle ouvreur de l'écrevisse (Cooper et Cooper, 2009) est utilisé dans cette préparation. Le PPSE quantique directement sur ​​les régions identifiables de la terminaison nerveuse sont enregistrées en plaçant la lumière d'une électrode d'enregistrement de macro-patch sur varicosités synaptiques visualisé avec le colorant vital 4-di-2-Asp (5 uM, 5 min de traitement, Cooper et al, 1995;. Magrassi et al, 1987).. Le spontanées ainsi que les réponses évoquées quantiques peuvent être enregistrés en même temps les terminaisons nerveuses. Le évoquée et spontanée potentiels synaptiques sont enregistrées avec l'électrode macro-patch (Dudel, 1981; Wojtowicz et al, 1991;. Mallart, 1993). Kimax verre (diamètre extérieur: 1,5 mm) a été tiré et polie au feu pour produire des conseils de patch avec des diamètres intérieurs allant de 10 à 20 um (figure 15).

   
   Figure 15: La lumière d'une électrode d'enregistrement de macro-patch ..

   La lumière de l'électrode est remplie avec le milieu de bain. L'amplificateur est le même que celui utilisé pour les enregistrements intracellulaires mentionnés ci-dessus. Électrodes et la résistance d'étanchéité peut être déterminé par le passage des impulsions de test courant à travers l'électrode. Dans nos expériences, les résistances joint variait de 0,3 à 1,0 MOhm et la résistance de l'électrode variait de 0,5 à 1,0 MOhm. Résistance Seal peut être surveillé tout au long de l'enregistrement.

2. Comptage direct des événements quantiques est possible avec des fréquences de stimulation faible. Pour chaque réponse évoquée, le nombre d'événements quantiques peut être facilement déterminée pour les bornes de sortie faible (Figure 16). Ces chiffres directe peut aider à estimer la teneur moyenne quantique (Del Castillo & Katz, 1954;. Cooper et al, 1995). Depuis le NMJs évoqué à haut rendement produisent plusieurs événements évoqués quantique, l'amplitude moyenne ou de la zone de la déviation, avec l'amplitude maximale moyenne ou de la zone des événements spontanés, peut être utilisé pour approcher la teneur moyenne quantique (Cooper et al. , 1995).

   
   Figure 16 Focale traces enregistrées à partir d'un phasique et un JNM tonique.

   
   Figure 17

Discussion

Nous avons démontré dans ce rapport comment disséquer, d'enregistrer et de quantifier les réponses synaptiques dans une préparation d'écrevisses uniques neuromusculaires dans laquelle des terminaux à la fois haute et basse-sortie innervent les fibres musculaires mêmes. Les préparatifs neuromusculaires dans les écrevisses offrent de nombreux avantages sur la jonction neuromusculaire des vertébrés, puisque seuls quelques neurones moteurs excitateurs sont nécessaires pour innerver un muscle, et depuis les neurones sont identifiables de la préparation à la préparation (Atwood, 1976). En outre, le neurotransmetteur excitateur est le glutamate, et les potentiels postsynaptiques excitateurs (PPSE) sont notés, ainsi, les propriétés biophysiques des événements classés sont analogues aux dendrites des neurones dans le SNC des vertébrés. Les courants quantiques, cependant, peut être contrôlé directement sur ​​les sites postsynaptiques (Cooper et al., 1995).

Répétitifs de stimulation 5 Hz du nerf phasique donne lieu à de grandes EPSP qui deviennent déprimés grandement après plusieurs minutes. Ce type de dépression est fréquente chez les arthropodes phasique jonctions neuromusculaires (Atwood et Cooper, 1996). La présence de bornes toniques aux côtés des terminaux phasique permet d'évaluer si oui ou non la cible postsynaptique est fortement modifiée pendant et après la dépression de l'phasique des neurones moteurs. En outre, les bornes de sortie faible fournir une préparation agréable à étudier les mécanismes qui sous-tendent la facilitation synaptique (Desai et Shah et al, 2008;. Desai et Shah et Cooper, 2009)

Les bornes de sortie élevée de fournir un terrain de jeux pour enquêter sur la modulation du taux de dépression synaptique et le processus de récupération. Des préparations accessibles et viables devraient aider à déchiffrer les mécanismes derrière la dépression synaptique. Dans cette préparation extenseurs écrevisses jambe, l'application exogène de la sérotonine est un autre outil pour enquêter sur la récupération de la dépression synaptique et potentiellement un moyen de favoriser enquête sur la mobilisation des piscines des vésicules synaptiques. Cette préparation offre plusieurs avantages expérimentaux, car les fibres musculaires individuelles sont innervées par les neurones moteurs deux phasique et tonique.

Depuis la sérotonine augmente le nombre de vésicules qui sont libérées par stimulation évoqué, et comme elle favorise la récupération lors de la dépression, il est évident qu'il ya une certaine modulation de la vésicule piscines pour améliorer la probabilité de fusion avec la sérotonine présents (Johnstone et al., 2008 ; Logsdon et al, 2006;. Sparks et al, 2004).. Les modèles qui pourrait expliquer la dynamique de la vésicule piscines dans la terminaison nerveuse présynaptique pendant la stimulation à basse fréquence, par opposition à un état dépressif, doivent également être considérées parmi les différents protocoles expérimentaux qui sont possibles avec cette préparation.

Il a été noté dans d'autres systèmes que près de 30% du pool de vésicules subit un recyclage rapide, tandis que le reste des vésicules recyclées passer par un chemin de recyclage ralentir traditionnelle à travers le réticulum endoplasmique (Harata et al, 2001;. Tsien et al. , 2001). Ces pistes doubles peuvent aussi être présents dans ce système. Si l'ATP qui manque dans l'état déprimé de la terminaison présynaptique, alors arrimage et le désarrimage pourrait ne pas être en mesure de produire, ainsi, de nombreuses vésicules plus déchargé resterait à la surface synaptique. Depuis plus de vésicules sont libérés rapidement lorsque les bornes sont exposés à 5 HT, il est possible que d'autres sont contenues dans la piscine facilement libérable (RRV). Cependant, dans l'état déprimé, avec réduction de l'ATP, l'arrimage et le désarrimage peut être bloquée, même en présence de 5 HT, ce qui laisse encore une fois déchargés vésicules synaptiques à la surface. Depuis les données préliminaires suggèrent que plus de vésicules sont libérées dans le temps avec une exposition prolongée 5 HT et la stimulation, la distribution de la piscine des vésicules à partir des chemins de recyclage rapide et lente peut être biaisée pour avoir vésicules compétente pour ré-édition (de Johnstone et al. , 2008, voir commentaires-Desai-Shah et al, 2008;. Desai et Shah et Cooper, 2009)

Avec les techniques d'enregistrements macropatch focal de courants postsynaptiques et des mesures de quanta unique à partir des régions définies de la terminaison nerveuse motrice, on peut se poser des questions afin de déterminer si la dépression synaptique se produit comme un résultat de moins de vésicules d'être libéré ou en raison d'altérations de la fonction des récepteurs post-synaptiques. Il a été démontré que les vésicules sont plus sensibles à la fusion à la JNM phasique de cette préparation pour une exposition de calcium égal (Miller et al. 2005), ce qui explique probablement le plus la teneur moyenne quantique des bornes phasique (Msghina et al. , 1998, 1999). En outre, les différences dans les protéines liant le calcium frequenin (Jeromin et al., 1999) et de l'ultrastructure (King et al., 1996) contribuent à l'efficacité différentielle synaptique (Cooperet al., 2003).

Certaines études antérieures ont exploré le phénotype musculaire des fibres des muscles extenseurs (Bradacs et al, 1997;. Cooper et al, 2003).. En comparant la réglementation de la différenciation des types de fibres musculaires purement tonique et phasique de l'écrevisse à des types de fibres mixtes, comme pour les extenseurs de la jambe qui est dûment innervé, pourrait fournir des indices sur l'expression du phénotype musculaire et de la réglementation (Laframboise et al, 2000;. Sohn et al, 2000;. Griffis et al, 2001;. Mykles et al, 2002)..

De nombreuses questions fondamentales restent à régler en neurobiologie, et cette préparation peut aider à lutter contre certains d'entre eux. Quelques thèmes d'intérêt dans le domaine aujourd'hui qui pourrait être abordé avec les extenseurs de la jambe comprennent: 1) Déterminer les mécanismes cellulaires qui sous-tendent la dépression synaptique au sein de haute bornes de sortie (Est de la dépression due à une réduction de Ca2 + entrée, l'absence d'une autorité compétente facilement libérable vésicules (RRV) piscine, et / ou modifiés réceptivité postsynaptique?) 2) Déterminer le rôle mécaniste de la 5-HT lorsqu'il est appliqué après l'induction de la dépression synaptique à promouvoir une récupération plus rapide, et 3) Déterminer si les formes des quantiques courants qui résultent de la stimulation phasique bornes sont modifiés pendant l'induction de la dépression à l'adresse des composants pré-et post-synaptiques de la dépression synaptique.

Cette JNM est important de recherche en cours et futurs chercheurs, car il nous permet d'obtenir des informations pertinentes qui aborde les mécanismes sous-fifre de performance synaptique mesurée directement sur les sites libération. Les recherches actuelles dans ce domaine est fournir des informations sur la modulation de la dépression synaptique par des récepteurs 5-HT et la dynamique des bassins vésicule. Ces sujets portent sur les bases fondamentales de la transmission synaptique pertinente pour tous les systèmes neuronaux.

Materials

Crayfish (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA. Standard crayfish saline: Modified from Van Harreveld's solution (1936). (in mM) 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl22H2O; 2.45 MgCl26H2O; 5 HEPES and adjusted to pH 7.4 Dissection tools: Fine #5 tweezers, fine scissors, knife blade holder, #26002-20 insect pins (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) Sylgard coated dissection dish, a recording dish either constructed with suction electrode or use a suction electrode and anther manipulator to hold a suction electrode. Dissecting microscope with zoom function for intracellular recordings. For focal recording on visualized terminals a compound microscope with upright objectives (4 x and 20X) is used. One needs a Hg light source. Standard intracellular amplifier and A/D board for on line recording to a computer. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab/4s interface (ADInstruments, Australia). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope. Chemicals: We use a vital fluorescent dye, 4 [4 (diethylamino) styryl] N methylpyridinium iodide (4 Di 2 Asp; Molecular Probes, Eugene, OR), to visualize the varicosities (Marigassi et al., 1987; Cooper et al., 1995a). All saline chemicals were obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO). For intracellular recordings we use glass capillary tubing (catalogue # 30-31-0 from FHC, Brunswick, ME, 04011, USA) and for focal macropatch electrodes we use Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0.8-1.1mm, length 100mm. The intracellular electrode should have a resistance of 20 to 30 mOhm. The macropatch electrode is constructed by breaking off the tip of the glass after a fine tip was made from an electrode puller. The broken off tip needs to be a clean perpendicular break about 20μM in diameter. The tip is then heat polished to about 10μM inner diameter. The shaft of the electrode is then run over a heating element to cause it to bend about 45 degrees with a gradual bend. This produces a flat or perpendicular electrode lumen over the nerve terminal as the angle with the micro-manipulator will produce about another 45 degrees to the preparation.