Gravações fisiológicos de NMJs Output High and Low no músculo extensor Crayfish Leg

Summary

Este artigo demonstra como realizar gravações eletrofisiológicas de respostas sináptica no músculo extensor da perna andando de um lagostim e como os terminais nervosos são visualizados para mostrar as diferenças morfológicas bruta de alta e de baixa produção terminais nervosos.

Abstract

Nós explicamos em detalhes como expor e realizar gravações eletrofisiológicas de respostas sináptica de alta (fásica) e baixo (tônica) neurônios motores saída inervação do músculo extensor da perna andando de um lagostim. Diferenças distintas estão presentes na fisiologia e morfologia dos terminais nervosos fásicas e tônicas. O axônio tônica contém muitos mais mitocôndrias, permitindo-lhe tirar uma mancha vital mais intensa do que o axônio fásica. Os terminais têm varizes tônica e fásica do terminal é filiforme. Os terminais tônica são baixos em eficácia sináptica, mas mostram dramáticas respostas facilitada. Em contraste, os terminais fásica são ricos em eficácia quântica, mas apresentar depressão sináptica com a estimulação de alta freqüência. A saída quântica é medido com um eletrodo macropatch focal colocados diretamente sobre os terminais nervosos visualizado. Ambos os terminais fásicas e tônicas inervam as fibras musculares mesmo, o que sugere que as diferenças inerentes aos neurônios, em vez de um feedback diferencial retrógrada do músculo, conta para a diferenciação morfológica e fisiológica.

Protocol

1) Introdução

Neurônios motores comunicar com uma fibra muscular nas sinapses que são referidos coletivamente como uma junção neuromuscular (MNJ). NMJs pode ser acessado facilmente em preparações mais músculo lagostim. Muitos dos NMJs lagostas demonstrar não spiking potenciais pós-sinápticos excitatórios (EPSP) similar aos sinais elétricos gerados classificados nos dendritos pós-sinápticos no SNC de mamíferos ou respostas subliminares observado no NMJs vertebrados (Wiersma & Van Harreveld, 1938; Katz & Kuffler, 1946) . O NMJs lagostas podem servir como modelos fundamentais synaptic para fornecer informações gerais para a transmissão sináptica e diferenciação sináptica.

Geralmente, unidades motoras regular aspectos do comportamento animal através do tipo de comunicação sináptica em NMJs e propriedades dos músculos. Desde a primeira observação de "fast" e "lento" contrações musculares em caranguejo e lagosta mais perto muscular (Lucas, 1907, 1917), a diferenciação muscular contrátil semelhante tem sido descrita em outros tipos de crustáceos, como músculo flexor abdominal (Kennedy & Takeda, 1965a , b) e extensores dos membros (Van Harreveld & Wiersma, 1936). "Fast" contrações iniciar respostas rápidas. Por exemplo, o flip tail crustáceo é um comportamento rápido. "Slow" contrações manter movimentos lentos e ajudar a manter a postura (Bradacs et al., 1997). Correspondente ao "rápido" e "lento" contrações musculares ", saída fásica / alta" e "tônico de saída / baixa" são amplamente utilizados para descrever os neurônios motores. A diferença na taxa e tempo de contração muscular é em parte relacionada a diferenças na estrutura pré-sináptico sináptico e força sináptica (King et al., 1996). Proteínas miofibrilares expressão isoforma também é importante nas diferenças contráteis, mas em preparações como a do músculo extensor da perna, na qual uma fibra dado é inervada por dois tipos de neurônios motores, o foco é sobre as diferenças sináptica dos terminais, já que os terminais partes da célula-alvo mesmo (Mykles et al., 2002). Um estudo anterior examinou os dois axônios motores excitatórios dos extensores da perna e descreveu os fenótipos fásicas e tônicas (Bradacs et al., 1997). Neste relatório, nós demonstramos como realizar a dissecção e obter as gravações para que outros possam continuar a investigar as propriedades da diferenciação sináptica desses terminais nervosos.

Vistos com microscopia eletrônica de transmissão, várias séries de cortes obtidos a partir da tônica e fásica terminais de lagostas do músculo extensor da perna revelou que os terminais tônica vesículas contêm mais do que RRP terminais fásica; as mitocôndrias são mais prevalentes em neurônios tônica, e as sinapses nos terminais fásica são mais complexas do que aquelas em sinapses de baixo rendimento, uma vez que contêm várias zonas ativas com espaçamento variado (Miller et al, 2002; Johnstone et al, 2008;. King et al, 1996;.. Bradacs et al, 1997). O baixo rendimento terminais tônica também são mais suscetíveis de aumentar a transmissão sináptica com a serotonina neuromodulador (5-HT) do que são os terminais fásica (Cooper et al., 2003).

O fato de que a tônica e fásica MNJ estão presentes na mesma fibra muscular torna mais fácil avaliar as diferenças pré-sináptica em uma fibra muscular determinado e para abordar questões de fadiga muscular, depressão sináptica e conversas cruzadas sináptica. Várias questões continuam por resolver nesta preparação, como se há diferenças na densidade do receptor pós-sináptico e subtipos de receptores de glutamato nas metas pós-sináptico para a tônica e fásica terminais, mas uma melhor compreensão das diferenças fundamentais na anatomia e fisiologia destes duas unidades motoras ajudará na construção de uma base de conhecimento mais profundo. A esperança é que os princípios fundamentais aprendeu nesta preparação synaptic será aplicável a outras sinapses em várias preparações e vai reforçar as investigações futuras neste modelo sináptico da lagosta.

2) Métodos

1. Todos os experimentos são conduzidos nas pernas primeiro ou segundo andar de lagostas de tamanho médio (Procambarus clarkii). Os animais são alojados individualmente em recipientes plásticos com água oxigenado. A temperatura do quarto animal é na faixa de 13 ° C-16 ° C. Os animais são alimentados com comida de peixe seco ea água alterada em uma base semanal.

   
   Figura 1: Esquema de uma perna lagostas andando e os seis segmentos distal.

2. O aspecto distal da perna andando em um crustáceo é anatomicamente dividido em seis segmentos (Figura 1). O extensor de perna está localizado no meropodite, eo feixe de nervos que será isolado é perto do ischiopodite meropodite conjunta. O axônio tônica ou fásica podem be seletivamente estimuladas, conforme necessário para fins fisiológicos depois de serem expostos.
3. Cooper e Cooper (2009) descreveu alguns aspectos da dissecção inicial, incluindo métodos para expor o Excitor do motor abridor de neurônio na região meropodite, mas sua descrição não fornece os cuidados necessários para proteger o músculo extensor de danos, como era não é necessário para lidar com a preparação do músculo abridor. , A fim de proteger o extensor, a perna andando de primeira ou segunda é removido do crustáceo, medindo 60-10 cm de comprimento do corpo (Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA), induzindo o animal a automatizar o membro com beliscar forte distal ao plano de fratura no segmento ischiopodite. A perna é colocada sobre a placa com a dissecção lateral (lado externo) de frente para o espectador. A perna está ligado ao redor até que o espectador pode ter certeza de fora (lateral) é voltada para cima sobre a placa de dissecação, geralmente com o lado arqueado para cima (Figura 2). Colocando a perna em um pedaço de papel de tecido facilita a sua vez a preparação ao fazer esses cortes.

   
   Figura 2: A lateral da meropodite, geralmente o lado que é arqueado, está voltado para cima na placa de dissecção ..

4. Com um disjuntor de lâmina de bisturi e titular, uma lâmina afiada é usada para a cutícula etch até pouco cortando no padrão mostrado na Figura 3 para o segmento meropodite. Cuidado é tomado para não cortar demais distal na dorsal para cortar ventral pela articulação meropodite-carpopodite.

   
   Figura 3: O segmento meropodite com linhas como um padrão sugerido para ataque para fora da janela de cutícula.

   A preparação é colocada em solução salina. O prato deve ter uma dissecção Sylgard revestimento (Dow Corning) na parte inferior (1cm de espessura). Sylgard A é usado para que os pinos de insetos pode ser preso a ele para segurar a preparação ainda. Neste ponto, um pino é preso no meio do segmento carpopodite e no aspecto dorsal do segmento ischiopodite (Figura 4). Preparações dissecados são banhadas em solução salina lagostas padrão, modificadas a partir da solução Van Harreveld s (1936), que é feita com 205 NaCl; 5.3KCl; 13,5 CaCl _2; 2H ₂ O, 2,45 MgCl _2; 6H ₂ O, 5 HEPES e ajustados para pH 7,4 (em mM).

   
   Figura 4: O segmento meropodite com janela cortada sendo levantado. Observe a localização dos pinos dissecção.

5. A cutícula é levemente levantada na região distal e as fibras musculares são cortados a partir da cutícula, fazendo cursos para a base da perna. A cutícula pode ser retirada.
6. O apodeme (tendão) é cortado na articulação meropodite-carpopodite. Um pino é colocado sobre a superfície interna do tendão flexor para mostrar onde o corte é para ser feita (Figura 5). O tendão é então comprimido onde foi cortado com uma pinça e do músculo flexor puxado para fora, levantando-o em uma direção caudal (Figura 6), expondo o nervo da perna principal eo músculo extensor.

   
   Figura 5: O apodeme do músculo flexor é destaque deslocando-o do flexor com um alfinete.

   
   Figura 6: O apodeme do músculo flexor é cortada e removida com cuidado para não danificar o nervo da perna principal.

7. O nervo da perna principal é cortar na articulação meropodite-carpopodite e cuidadosamente puxado para trás sobre o músculo extensor. A superfície medial do músculo é usado ao longo deste estudo. A separação do nervo para o músculo extensor do nervo principal da perna pode ser melhorada, puxando levemente o coto distal do nervo principal da perna para o lado da preparação. Ao descascar o nervo da perna principal para trás sobre o músculo extensor, pequenos ramos de axônio pode precisar de ser cortado. Estes são ramos do neurônio motor inibitórios para o músculo extensor. O maior pacote de ramificação do nervo da perna principal perto da extremidade proximal do meropodite é o feixe de nervos pequenos de interesse.

   
   Figura 7: O nervo da perna principal é cortado e puxado para trás em uma direção proximal.

   Este feixe de nervos pode ser visto com coloração de azul de metileno (Figura 8) ou com 4-Di-2-ASP fluorescentes mancha (Figura 9).

   
   Figura 8: O músculo extensor manchado com azul de metileno. Observe a ramificação do axônio e osdois axônios facilmente visível dentro do nervo. Red setas demarcar a pista do nervo.

   
   Figura 9: Os axônios do nervo motor manchada com 4-Di-2-ASP. O axônio tônica é mais brilhante visível devido ao maior conteúdo mitocondrial.

   
   Figura 10A: terminais de neurônios individuais fásicas e tônicas corados com 4-Di-2-ASP. Observe o varicosidades nos terminais tônica ea natureza dos terminais thin fásica.

   
   Figura 10B-Tonic observou

   
   Figura 10C-fásicos observou

3) Perfis fisiológicos

1. Para observar os potenciais excitatórios pós-sinápticos (EPSPs) dos neurônios tônica ou fásica, um dos axônios isolados no feixe de nervos é estimulado por um eletrodo de sucção (figura 11) conectados a um estimulador Grass enquanto potenciais intracelulares no músculo são monitorados (Johnstone et al., 2008). Estimulação a 70 Hz é aplicado para o axônio tônica, a fim de promover uma resposta facilitado para o NMJs de baixo débito, ou um único pulso (1 Hz) é aplicado para o axônio fásica a fim de obter EPSPs grandes da saída de alta NMJs como mostrado na Figura 12. O EPSPs são gravados para um computador através de uma interface PowerLab/4s.

   
   Figura 11: Estimular eletrodo colocado sobre um único axônio dentro do feixe de nervos. Observe a linha verde delineando as duas principais axônios.

   
   Figura 12: potenciais pós-sinápticos (EPSPs) dos neurônios tônica ou fásica como obtidas por gravações intracelular.

2. Investigação da natureza da facilitação sináptica e depressão sináptica pode ser abordado por vários paradigmas experimentais com o NMJs de saída baixa e alta. Facilitação da NMJs baixo débito depende da freqüência, como mostrado para os pulsos 20, 40 e 60 Hz de cerca de 20 estímulos (Figura 13).

   
   Figura 13: EPSPs em resposta a um trem de pulsos de estimulação dada em três diferentes freqüências 20, 40 e 60 Hz em solução salina lagostas normal.

3. A taxa de depressão sináptica à freqüência de estimulação também está relacionada ao NMJs alto rendimento. Figura 14 mostra um 5 Hz de estimulação contínua pressionando o MNJ mais de 30 min. Com maior frequência de estimulação, a preparação vai diminuir mais rapidamente (Bradacs et al., 1997).

   
   Figura 14: EPSP amplitude da resposta fásica durante 5 Hz a estimulação para induzir a depressão.

4) As respostas quântica

1. Um procedimento semelhante ao descrito para o músculo opener do lagostim (Cooper e Cooper, 2009) é utilizado nesta preparação. O EPSPs quantal diretamente sobre regiões identificáveis ​​do terminal nervoso são registrados, colocando a luz de um eletrodo de registro macro-patch em varicosidades sináptica visualizado com o corante vital 4-Di-2-Asp (5 M, 5 min de tratamento, Cooper et al, 1995;. Magrassi et al, 1987).. O espontâneo, bem como as respostas evocadas quântica podem ser registradas ao longo dos terminais nervosos. O evocada e espontânea potenciais sinápticos são registradas com o eletrodo macro-patch (Dudel, 1981; Wojtowicz et al, 1991;. Mallart, 1993). Kimax de vidro (diâmetro externo: 1,5 mm) foi puxado e fogo-polido para produzir dicas patch com diâmetros internos variando de 10 a 20 microns (Figura 15).

   
   Figura 15: A luz de um eletrodo de registro macro-patch ..

   O lúmen do eletrodo é preenchido com o meio de banho. O amplificador é o mesmo que o usado para as gravações intracelular mencionados acima. Eletrodo ea resistência selo pode ser determinada passando impulsos de teste de corrente através do eletrodo. Em nossos experimentos, resistências selo variou 0,3-1,0 MOhm ea resistência do eletrodo variou 0,5-1,0 MOhm. Resistência selo pode ser monitorada durante a gravação.

2. Contagem direta de eventos quântica é possível com freqüências de estimulação baixa. Para cada resposta evocada, o número de eventos quântica pode ser facilmente determinado para os terminais de saída baixa (Figure 16). Estas contagens diretas podem ajudar a estimar o teor médio quântica (Del Castillo & Katz, 1954;. Cooper et al, 1995). Desde o evocado NMJs saída de alta produção de multi-quantal eventos evocados, a amplitude média da zona de desvios, juntamente com a amplitude de pico média ou área de eventos espontâneos, pode ser usado para aproximar o conteúdo significa quântica (Cooper et al. , 1995).

   
   Figura 16 traços Focal gravados de um fásica e tônica MNJ.

   
   Figura 17

Discussion

Nós demonstramos neste relatório como dissecar, registrar e quantificar as respostas sinápticas em uma preparação neuromuscular lagostas único em que ambos os terminais de alta e de baixa produção inervam as fibras musculares mesmo. Os preparativos neuromuscular na lagostas oferecem muitas vantagens sobre as junções neuromusculares vertebrados, uma vez que apenas alguns neurônios motores excitatórios são necessários para inervam um músculo, e uma vez que os neurônios são identificáveis, desde a preparação para a preparação (Atwood, 1976). Além disso, o neurotransmissor excitatório é o glutamato, e os potenciais pós-sinápticos excitatórios (EPSP) são classificados, assim, as propriedades biofísicas de eventos classificados são análogas às dendrites dos neurónios no SNC de vertebrados. As correntes quântica, no entanto, podem ser monitoradas diretamente nos locais pós-sinápticos (Cooper et al., 1995).

Estimulação repetitiva 5 Hz do nervo fásica dá origem a EPSPs grandes que se tornam extremamente deprimida depois de vários minutos. Este tipo de depressão é comum em artrópodes fásica neuromuscular junções (Atwood e Cooper, 1996). A presença dos terminais tônica ao lado dos terminais fásica permite avaliar se o alvo pós-sináptica é bastante modificado durante e após a depressão do fásica do neurônio motor. Além disso, os terminais de saída de baixa fornecer uma preparação boa para investigar os mecanismos que estão por trás de facilitação sináptica (Desai-Shah et al, 2008;. Desai-Shah e Cooper, 2009)

Os terminais de saída de alta proporcionar um play ground para investigar a modulação da taxa de depressão sináptica eo processo de recuperação. Preparações acessível e viável deve ajudar a decifrar os mecanismos por trás da depressão sináptica. Nessa preparação extensor lagostas perna, aplicação exógena de serotonina é outra ferramenta para investigar a recuperação da depressão sináptica e, potencialmente, um meio de promover investigação sobre a mobilização de piscinas das vesículas sinápticas. Esta preparação proporciona várias vantagens experimental, já que as fibras musculares individuais são inervadas por neurônios motores tanto fásicas e tônicas.

Como a serotonina aumenta o número de vesículas que são liberados com a estimulação evocada, e uma vez que promove a recuperação durante a depressão, é evidente que há alguma modulação das piscinas vesícula para aumentar a probabilidade de fusão com a presença de serotonina (Johnstone et al., 2008 ; Logsdon et al, 2006;. Sparks et al, 2004).. Modelos que explicam a dinâmica das piscinas vesícula dentro do terminal nervoso pré-sináptico durante a estimulação de baixa freqüência, em oposição a um estado depressivo, também precisam ser considerados entre os diferentes protocolos experimentais que são possíveis com esta preparação.

Tem-se observado em outros sistemas que cerca de 30% do pool vesícula passa por uma reciclagem rápida, enquanto que o resto das vesículas reciclados passar por um caminho tradicional de reciclagem lenta através do retículo endoplasmático (Harata et al, 2001;. Tsien et al. , 2001). Tais caminhos dupla também podem estar presentes neste sistema. Se ATP está faltando no estado depressivo do terminal pré-sináptico, em seguida, encaixe e desencaixe pode não ser capaz de ocorrer, assim, muitas vesículas mais descarregados permaneceria na superfície sináptica. Desde vesículas são mais rapidamente liberado quando os terminais estão expostos a 5-HT, é possível que mais estão contidos dentro da piscina prontamente liberável (RRV). No entanto, no estado depressivo, com redução da ATP, a atracação e desatracação podem ser bloqueados, mesmo na presença de 5 HT, que novamente sai vesículas descarregado na superfície sináptica. Desde que os dados preliminares sugerem que as vesículas são liberados ao longo do tempo com a exposição prolongada HT 5 e estimulação, a distribuição da piscina vesícula dos caminhos de reciclagem rápida e lenta pode ser inclinado para ter vesículas competente para re-lançamento (de Johnstone et al. , 2008; ver reviews-Desai-Shah et al, 2008;. Desai-Shah e Cooper, 2009)

Com as técnicas de gravações macropatch focal das correntes pós-sináptico e medidas de quanta única das regiões definidas do terminal nervoso motor, pode-se fazer perguntas para determinar se a depressão sináptica está ocorrendo como resultado de vesículas menos ser liberado ou por causa de alterações da função de receptores pós-sinápticos. Tem sido demonstrado que as vesículas são mais sensíveis à fusão no MNJ fásica da preparação para uma exposição de cálcio iguais (Miller et al. 2005), o que provavelmente contribui para o maior teor médio de quantal dos terminais fásica (Msghina et al. , 1998, 1999). Além disso, as diferenças no frequenin proteínas, cálcio binding (Jeromin et al., 1999) e ultra-estrutura (King et al., 1996) contribuem para a eficácia diferencial sináptica (Cooperet al., 2003).

Alguns estudos anteriores têm explorado o fenótipo muscular das fibras musculares extensor (Bradacs et al, 1997;. Cooper et al, 2003).. Comparando-se a regulação da diferenciação muscular para tipos de fibras puramente tônica e fásica do crustáceo para tipos de fibras mistas, como para os extensores da perna que é inervada devidamente, pode fornecer pistas para a expressão muscular fenótipo e regulação (LaFramboise et al, 2000;. Sohn et al, 2000;. Griffis et al, 2001;. Mykles et al, 2002)..

Muitas questões fundamentais continuam a ser combatidos em neurobiologia, e esta preparação pode ajudar na luta contra alguns deles. A alguns tópicos de interesse no campo, hoje, que pode ser abordada com o extensor da perna incluem: 1) Determinar os mecanismos celulares subjacentes à depressão sináptica dentro alta terminais de saída (Is a depressão devido a uma redução de Ca2 + entrada, falta de uma competente prontamente liberável vesícula piscina (RRV), e / ou pós-sinápticos receptividade alteradas?) 2) Determinar o papel mecanicista da 5-HT, quando aplicado após a indução de depressão sináptica para promover uma recuperação mais rápida, e 3) Determinar se as formas das quantal correntes que surgem a partir da estimulação fásica terminais estão sendo alterados durante a indução de depressão para tratar componentes pré e pós-sináptico de depressão sináptica.

Este MNJ é importante para a investigação em curso e futuros pesquisadores, porque permite-nos obter informação pertinente que aborda os mecanismos de subalterno de desempenho sináptica medida diretamente nos locais de lançamento. A pesquisa atual nesta área é fornecer informações sobre a modulação da depressão sináptica de 5-HT e da dinâmica das piscinas vesícula. Temas dizem respeito aos princípios fundamentais da transmissão sináptica relevantes para todos os sistemas neural.

Materials

Crayfish (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA. Standard crayfish saline: Modified from Van Harreveld's solution (1936). (in mM) 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl22H2O; 2.45 MgCl26H2O; 5 HEPES and adjusted to pH 7.4 Dissection tools: Fine #5 tweezers, fine scissors, knife blade holder, #26002-20 insect pins (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) Sylgard coated dissection dish, a recording dish either constructed with suction electrode or use a suction electrode and anther manipulator to hold a suction electrode. Dissecting microscope with zoom function for intracellular recordings. For focal recording on visualized terminals a compound microscope with upright objectives (4 x and 20X) is used. One needs a Hg light source. Standard intracellular amplifier and A/D board for on line recording to a computer. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab/4s interface (ADInstruments, Australia). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope. Chemicals: We use a vital fluorescent dye, 4 [4 (diethylamino) styryl] N methylpyridinium iodide (4 Di 2 Asp; Molecular Probes, Eugene, OR), to visualize the varicosities (Marigassi et al., 1987; Cooper et al., 1995a). All saline chemicals were obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO). For intracellular recordings we use glass capillary tubing (catalogue # 30-31-0 from FHC, Brunswick, ME, 04011, USA) and for focal macropatch electrodes we use Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0.8-1.1mm, length 100mm. The intracellular electrode should have a resistance of 20 to 30 mOhm. The macropatch electrode is constructed by breaking off the tip of the glass after a fine tip was made from an electrode puller. The broken off tip needs to be a clean perpendicular break about 20μM in diameter. The tip is then heat polished to about 10μM inner diameter. The shaft of the electrode is then run over a heating element to cause it to bend about 45 degrees with a gradual bend. This produces a flat or perpendicular electrode lumen over the nerve terminal as the angle with the micro-manipulator will produce about another 45 degrees to the preparation.