Мы предоставляем шаг за шагом протокол для цельноклеточной патч зажим записи кальция Release-активированный кальций (CRAC) токов в периферической крови мононуклеарных клеток происхождения человека Т-лимфоцитов.
В Т-лимфоциты, истощение Са 2 + из внутриклеточных Са 2 + магазине приводит к активации plasmalemmal Ca 2 + каналы, называемые Кальций Release-активированный кальций (CRAC) каналов. CRAC каналы играют важную роль в регуляции клеточной пролиферации Т и экспрессии генов. Аномальные канал CRAC функции Т-клеток была связана с тяжелым комбинированным иммунодефицитом и аутоиммунных заболеваний, 1, 2. Изучение CRAC функцию канала в человеческих Т-клеток может раскрыть новые молекулярные механизмы, регулирующие нормальный иммунный ответ и раскрыть причины человека, связанных с заболеваниями. Электрофизиологические записи мембранных токов обеспечивают наиболее точную оценку функциональных свойств канала и их регулирование. Электрофизиологические оценки CRAC токов канала в Jurkat Т-клетки, лейкемии человека Т-клеток линии, была впервые исполнена более чем 20 лет назад 3, однако, CRAC измерения тока в нормальных человеческих Т-клеток остается сложной задачей. Трудности в записи токов CRAC канала в нормальных клетках Т усугубляется тем, что кровь полученных Т-лимфоцитов значительно меньше по размеру, чем Jurkat Т-клеток и, таким образом, эндогенные цельноклеточная токов CRAC очень низкие по амплитуде. Здесь мы даем шаг за шагом процедуры, которые мы обычно используем для записи Са 2 + и Na + токи через CRAC каналов в состоянии покоя человека Т-клеток выделенных из периферической крови здоровых добровольцев. Метод, описанный здесь, был принят от процедур, используемых для записи CRAC токов в Jurkat Т-клеток и активированных Т-клетках человека 4-8.
Электрофизиологические исследования CRAC токи в состоянии покоя человека Т-клеток является сложной задачей, поскольку эндогенный CRAC амплитуды тока в этих клетках мало из-за небольшого размера ячейки (отдыха человека Т-клеток диаметром в диапазоне 5-8 мкм). Здесь мы представляем шаг за ша?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарны кафедры физиологии и мембранной биологии Калифорнийского университета Дэвиса за предоставление нам помещения и отличные условия для исследования ионных каналов.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
RosetteSep Human T Cell Enrichment Cocktail | StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada | 15061 | ||
RosetteSep Density Medium | StemCell Technologies | 15705 | ||
RPMI-in 1640 medium w/glutamine/HEPES | Fisher, Waltham, MA | SH3025501 | ||
Fetal Calf Serum | Omega Scientific, Tarzana, CA | FB-01 | ||
GlutaMAX-I (100X solution) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 35050 | ||
RPMI 1640 vitamin solution (100X) | Sigma-Aldrich | 7256 | ||
1640 amino acids solution (50X) | Sigma-Aldrich | R7131 | ||
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | ||
β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | ||
Inositol trisphosphate | Sigma-Aldrich | 19766 | ||
BAPTA | Sigma-Aldrich | A4926 | ||
Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | ||
Lanthanum Chloride | Sigma-Aldrich | 262072 | ||
Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | ||
Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit | Dow Corning, Midland, MI | 3097358-1004 | ||
HIPEC R6101 Semiconductor Protective Coating | Dow Corning, Midland, MI | |||
63-500 Series High-Performance Vibration Isolation Lab Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA | 63-540 | ||
EPC 10 patch clamp amplifier with headstage | HEKA Instruments, Bellmore, NY | |||
Micromanipulator | Sutter Instrument, Novato, CA | MP-285 | ||
Olympus 1X71 Inverted microscope with 40x oil immersion objective | Olympus America, Center Valley, PA | 1X71 | ||
Windows Computer | Dell | |||
Pulse software | HEKA Instruments | |||
Origin Scientific Graphing and Analysis Software | OriginLab, Northampton, MA | |||
Patch pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | ||
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5mm and I.D.: 1.10mm | Sutter Instrument | BF150-110-7.5 | ||
Narashige’s Microforge | Tritech Research, Los Angeles, CA | MF-830 | ||
Silicon O-rings | McMASTER-CARR, Santa Fe Springs, CA | 111 S70 | ||
Coverslips 25 mm | Fisher Scientific | 12-545-102 25 mm 25CIR.-1 |