Summary
Om neurale lijst stamcellen (NCSC) kweken in vitro, is een speciaal medium (NCSCM) vereist. Essentieel onderdeel van NCSCM is kippenembryo extract (CEE). We beschrijven hier accurate technieken om een maximale hoeveelheid van pure en hoge kwaliteit CEE, inclusief details zoals de isolatie, maceratie, centrifugeren en filtratie processen te produceren.
Abstract
De neurale lijst komt voort uit het neuro-ectoderm tijdens de embryogenese en blijft slechts tijdelijk. Vroege experimenten al ondoorlaatbaar pluripotente voorlopercellen naar een integraal onderdeel van de neurale lijst 1. Fenotypisch, zijn neurale stamcellen (NCSC) gedefinieerd door gelijktijdig te drukken p75 (low-affiene zenuw groeifactor receptor, LNGFR) en SOX10 tijdens hun migratie van de neurale lijst 2,3,4,5. Deze stamcellen kunnen differentiëren in gladde spiercellen, chroomaffiene cellen, neuronen en gliacellen, evenals melanocyten, kraakbeen en bot 6,7,8,9. Te cultiveren NCSC in vitro, een speciale neurale stamcellen medium (NCSCM) is vereist 10. Het meest complexe deel van de NCSCM is de voorbereiding van de kippenembryo extract (CEE) die een essentiële bron van groei factoren voor de NCSC als voor andere vormen van neurale explantaten. Andere NCSCM ingrediënten naast CEE zijn commercieel verkrijgbaar. Het produceren van CCE met behulp van laboratorium-standaard uitrusting is het van groot belang om te weten over de uitdagende details zoals de isolatie, maceratie, centrifugeren en filtratie processen. In dit protocol beschrijven we accurate technieken om een maximale hoeveelheid van pure en hoge kwaliteit CEE te produceren.
Protocol
De auteurs stellen dat experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese Gemeenschappen richtlijn (86/609/EEG), volgens de richtlijnen van de NIH ten aanzien van de zorg en het gebruik van dieren voor experimentele procedures en de regels uiteengezet door de Institutional Animal set zorg en gebruik Comite (IACUC) aan de Universiteit van Duisburg-Essen (Duitsland).
Deel 1: instellen (niet getoond op video)
VOORBEREIDEN materialen en oplossingen (voorafgaand aan het nemen van de eieren uit de broedmachine)
- Eieren moeten worden geïncubeerd in een bevochtigde incubator gedurende 11 dagen bij 37 ° C (100 ° F).
- 70% ethanol spray, schone borden, precies schone tang, 4 ° C (40 ° F) koud steriel DMEM op ijs en 60 ml steriele spuiten
- 50 ml steriele Corning buizen moeten worden half gevuld met 4 ° C koude DMEM aan de gemacereerd embryo's mix met een verhouding van 1:1 (geweekt massa: DMEM). Zodra de eitjes worden uit de incubator dissectie van de kippenembryo's moet worden gestart.
- Steriliseer dissectie-instrumenten in de autoclaaf of op de dag van de dissectie, dompel de tools in 70% ethanol gedurende 20 minuten.
Deel 2: Dissectie van de kippenembryo's (gedemonstreerd op Video)
- Wet van de bebroede eieren met een 70% ethanol spray voor minstens 30 seconden en zorgvuldig droog ze af met een schone zachte papieren zakdoekjes, terwijl niet schudden van de eieren overdreven.
Opmerking: We raden niet ontleden van meer dan 60 kippenembryo's tegelijk. - Voorzichtig open de eieren door de onstuimige tegen een scherpe rand en nemen het embryo met de nodige voorzichtigheid niet het vernietigen van de dooier zak of het kippenembryo zelf.
- Zoek naar het begin van de navelstreng snel en open de duidelijke verpakking, zonder het vernietigen van de dooier zak of een kleine schepen. Vervolgens ontleden de navelstreng met nauwkeurige schoon pincet.
- Neem het embryo uit de dooierzak.
Let op: Embryo's moeten snel worden onthoofd (niet getoond in de video). - Het verzamelen van de embryo's minimaal essentieel medium bij 4 ° C.
Deel 3: maceratie van de kippenembryo's
- Haal de zuiger van een 60 ml steriele spuit.
- Breng circa 10 embryo's in een 60 ml spuit.
- Zet de zuiger voorzichtig terug in de spuit om niet het risico te verliezen gemacereerde materiaal.
- Maceraat door erop te drukken de zuiger.
- Verzamel de geweekt massa in de voorbereide Corning buizen half-gevuld met DMEM in een verhouding van 1:1 (geweekt massa: DMEM). Met behulp van 10 embryo's een volume van ongeveer 25 ml is geproduceerd.
- Leg het mengsel op een shaker voor 45 min bij 4 ° C.
Deel 4: Centrifugeren van het kippenembryo - DMEM Suspension
- Breng de kippenembryo - DMEM suspensie in het centrifugeren buizen.
- Voeg steriele hyaluronidase bij een concentratie van 1 mg per 25 mg embryo.
- Tare het centrifugeren buisjes zeer nauwkeurig.
Opmerking: Deze stap moet worden uitgevoerd met de nodige voorzichtigheid centrifugeren draait op zeer hoge g-kracht en beschadiging van materiaal of centrifuge kan optreden bij gebruik van onevenwichtige buizen. Met een hoge nauwkeurigheid weegmachine overeenstemming ten aanzien van de drie posities na de decimale punt voor alle buizen te zijn ontvangen door het aanpassen van het ontbrekende bedrag met DMEM. - Verlaag de temperatuur van de centrifuge tot 4 ° C.
Let op: Ook het centrifugeren rotor moeten worden opgeslagen in een koelkamer of een koelkast gedurende een nacht. - Centrifugeer zes uur op zijn minst voor 180.000 xgx uur Opmerking: Voor superieure resultaten met betrekking tot de scheiding van de interne fasen gebruik 266.000 xgx h. Indien mogelijk, gebruik maken van de vacuum aanpassing.
Deel 5: Filtratie van de Chick Embryo Extract
Na het centrifugeren, kunnen drie fasen worden opgemerkt: De bovenste smoezelig vloeibare fase met vette fragmenten, de heldere vloeistof fase in het midden en de pellet op de bodem van de centrifugebuis. Opmerking: schudden of stevige verplaatsen van het mengsel gecentrifugeerd worden om strikt vermeden, omdat dit zou het resultaat van het centrifugeren stap te vernietigen door het verlies van de heldere centrale vloeibare fase.
Opmerking: Alle volgende stappen dienen te worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden gebruik van een laminaire luchtstroom bank:
- Pipetteer de heldere vloeistof fase in een filter systeem met poriën van 0,45 micrometer. Schakel dan de aangesloten vacuumpomp.
Opmerking: Raak de pellet aan de onderkant. Dit zou leiden tot een besmetting van het extract en een verstopping van het filter systeem. - Breng het pre-extract in een filter systeem met poriën van 0,22 urn en schakel de aangesloten vacuumpomp opnieuw.
- Aliquot de bereikte kuiken embryo extractin een steriele 15 ml Corning buizen.
- Snel de monsters op te slaan bij -80 ° C (-62 ° F). Opmerking: De CEE duren maximaal twee jaar indien bewaard bij -80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol is gebaseerd op de wijzigingen van de procedures die zijn beschreven in het verleden 10,11. Naast de voormalige publicaties we hier laten zien van de individuele verschillende stappen van het proces meer uitgebreid. Dit ondersteunt de onderzoeker met belangrijke gegevens te verzekeren de juiste procedures en betrouwbare resultaten. Verder, als de dissectie proces is een essentieel onderdeel van CEE extractie beschrijven we de procedure voor het nemen van de embryo's uit de dooierzak in elk detail. Er zijn een aantal belangrijke punten om op te merken, zoals hieronder besproken.
De dissectie van de kippenembryo's moet worden begonnen zo snel mogelijk na de incubatie is beëindigd. Embryo's dood voorafgaand aan de dissectie mag niet worden gebruikt voor de stappen van dit protocol zoals enzymatische activering en afbraak van eiwitten kan het resultaat negatief beïnvloeden.
Voordat u begint een aantal hand-on training dienen te worden uitgevoerd als alle stappen van de dissectie proces worden uitgevoerd snel en accuraat. Het is belangrijk voor het succes van de hele procedure, om te voorkomen dat besmetting met eigeel dat ging gepaard met een opmerkelijke hoeveelheid van negatief storende eiwitten. Na de embryo's werden uit de dooier zakken moeten ze snel worden onthoofd (niet getoond in de video).
Temperatuur en vlugheid van de rotor zijn erg belangrijk, ook. Om de enzymatische activering en een vermindering van de kwaliteit en kwantiteit van de factoren die nodig is voor de NCSCM voorkomen dat de temperatuur van de centrifuge en de rotor moet worden teruggebracht tot 4 ° C. Na de centrifugatie stap de heldere centrale vloeibare fase is het belangrijk pre-extract, die de essentiële groeifactoren voor de NCSCM. Om dit te bereiken een aanzienlijke scheiding van de verschillende fracties en een verrijking van de factoren die nodig is raden wij aan een spoed niet lager dan 180.000 xgx h.
Als het verschil in dichtheid tussen de heldere vloeistof fase en de groezelige vloeibare fase aan de bovenkant van de centrifugebuis belet niet dat een remixen van de twee delen alle schudden moet worden vermeden. De componenten van de smoezelige vloeibare fase niet kan worden gefiltreerd door een 0,45 urn filter systeem, als de vette delen ervan zou al snel leiden tot een verstopping van het filter systeem. Ook de pellet op de bodem van de centrifuge mag helemaal niet aangeraakt worden, omdat delen ervan zou leiden tot verstopping van het filter systeem.
In een laatste stap de mogelijkheden van de CEE voor de teelt van NCSCs moet worden gevalideerd. Deze multipotente voorbijgaande populatie van stamcellen verliest haar levensvatbaarheid snel in de media, zonder toegevoegde voldoende geproduceerd CEE. Daarom is een transgene muis lijn (JoMa1), die vroeg NCSC markers tot uitdrukking in een transgen-activiteit afhankelijke manier en wordt gebruikt om NCSC biologie studeren wordt gekweekt in elk nieuw verkregen verantwoordelijk voor CEE 10. De succesvolle teelt van NCSCs vertegenwoordigt een geschikte validatie van de CEE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De ondersteuning en advies van Markus Pajtler en Robert Bohrer waren van onschatbare waarde voor de visualisatie van dit protocol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 11 days incubated chicken eggs | Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH | ||
| Alcoholic disinfection spray | Schülke Mayr GmbH | ||
| DMEMGlutamax | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Syringe sterile (60 ml) | BD Biosciences | ||
| Tubes sterile (50; 15 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Pipet tips sterile | Starlab GmbH | ||
| Hyaluronidase typeIV-S | Sigma-Aldrich | ||
| Milipore stericups sterile (0.45; 0.22 μl) | Fisher Scientific | ||
| Pipettes sterile (25; 10; 5 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Centrifuge L5-50 | Rotor type Ti-45 |
References
- Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. Cell lineage analysis reveals multipotency of some avian neural crest cells. Nature. 335, 161-164 (1988).
- Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
- Rao, M. S., Anderson, D. J. Immortalization and controlled in vitro differentiation of murine multipotent neural crest stem cells. J Neurobiol. 32, 722-746 (1997).
- Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling. Cell. 128, 3949-3961 (2001).
- Kim, J., Lo, L., Dormand, E., Anderson, D. J. SOX10 maintains multipotency and inhibits neuronal differentiation of neural crest stem cells. Neuron. 38, 17-31 (2003).
- Anderson, D. J., Groves, A., Lo, L., Ma, Q., Rao, M., Shah, N. M., Sommer, L. Cell lineage determination and the control of neuronal identity in the neural crest. Review Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 62, 493-504 (1997).
- Dorsky, R. I., Moon, R. T., Raible, D. W. Environmental signals and cell fate specification in premigratory neural crest. Review Bioessays. 22, 708-716 (2000).
- Sieber-Blum, M. Factors controlling lineage specification in the neural crest. Int Rev Cytol. 197, 1-33 (2000).
- Dupin, E., Real, C., Ledouarin, N. The neural crest stem cells: control of neural crest cell fate and plasticity by endothelin-3. Int Rev Cytol. 73, 533-545 (2001).
- Maurer, J., Fuchs, S., Jäger, R., Kurz, B., Sommer, L., Schorle, H. Establishment and controlled differentiation of neural crest stem cell lines using conditional transgenesis. Differentiation. 75, 890-891 (2007).
- Wu, Y. Y., Mujtaba, T., Rao, M. S. Isolation of stem and precursor cells from fetal tissue. Methods Mol Biol. 198, 29-40 (2002).
