Summary
इन विट्रो में तंत्रिका शिखा स्टेम कोशिकाओं (NCSC) खेती, एक विशेष माध्यम (NCSCM) की आवश्यकता है. NCSCM का आवश्यक हिस्सा लड़की भ्रूण निकालने (CEE) है. हम यहाँ से सही तकनीक का वर्णन करने के लिए शुद्ध और उच्च गुणवत्ता CEE की एक अधिकतम राशि अलगाव, थकावट, centrifugation, और निस्पंदन प्रक्रियाओं के रूप में विवरण सहित उत्पादन.
Abstract
तंत्रिका शिखा embryogenesis दौरान न्यूरो बाह्य त्वक स्तर से उठता है और केवल अस्थायी तौर पर बनी रहती है. प्रारंभिक प्रयोगों को पहले से ही pluripotent पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं proofed तंत्रिका शिखा 1 के एक अभिन्न अंग होना है. Phenotypically, तंत्रिका शिखा स्टेम कोशिकाओं (NCSC) तंत्रिका शिखा 2,3,4,5 से अपने प्रवास के दौरान एक साथ p75 (कम affine तंत्रिका वृद्धि कारक रिसेप्टर, LNGFR) और SOX10 व्यक्त द्वारा परिभाषित कर रहे हैं. इन पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, chromaffin कोशिकाओं, न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं melanocytes के रूप में अच्छी तरह के रूप में उपास्थि और हड्डी 6,7,8,9 में अंतर कर सकते हैं . इन विट्रो, एक विशेष तंत्रिका शिखा स्टेम सेल मध्यम (NCSCM) में NCSC खेती के लिए 10 आवश्यक है . NCSCM का सबसे जटिल हिस्सा लड़की भ्रूण (CEE) निकालने NCSC के लिए के रूप में अच्छी तरह के रूप में तंत्रिका explants के अन्य प्रकार के लिए एक वृद्धि कारकों की आवश्यक स्रोत का प्रतिनिधित्व करने की तैयारी है. CEE के बगल में अन्य NCSCM सामग्री व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. उत्पादन सीसीई प्रयोगशाला का उपयोग मानक उपकरण यह उच्च महत्व का है अलगाव, थकावट, centrifugation, और निस्पंदन प्रक्रियाओं के रूप में चुनौतीपूर्ण विवरण के बारे में पता है. इस प्रोटोकॉल में हम सटीक शुद्ध और उच्च गुणवत्ता CEE की एक अधिकतम राशि का उत्पादन तकनीक का वर्णन.
Protocol
लेखकों राज्य है कि जानवरों पर प्रयोगों में प्रदर्शन किया गया यूरोपीय परिषद निर्देशक 86/609/EEC () समुदाय के अनुसार देखभाल और प्रयोगात्मक प्रक्रिया और संस्थागत पशु द्वारा निर्धारित नियमों के लिए पशुओं के उपयोग के बारे में NIH के दिशानिर्देश का पालन, देखभाल और विश्वविद्यालय ड्यूसबर्ग-Essen (जर्मनी) में समिति (IACUC) का उपयोग करें.
भाग 1: स्थापना (वीडियो पर नहीं दिखाया गया है)
माल और समाधान की तैयारी (पहले बाहर इनक्यूबेटर अंडे ले)
- अंडे humidified इनक्यूबेटर में 37 में 11 दिनों के लिए incubated डिग्री सेल्सियस (100 ° एफ).
- 70% इथेनॉल स्प्रे, स्वच्छ प्लेटों, सटीक साफ संदंश, 4 डिग्री सेल्सियस (40 ° F) बर्फ पर ठंड बाँझ DMEM और 60 एमएल बाँझ सीरिंज
- 50 एमएल बाँझ Corning ट्यूबों के लिए 4 के साथ आधा भरा ° सी ठंड DMEM 1:1 के अनुपात (: DMEM macerated मास) में macerated भ्रूण मिश्रण करने के लिए है. के रूप में जल्द ही के रूप में अंडे लड़की भ्रूण की इनक्यूबेटर विच्छेदन के बाहर ले रहे हैं करने के लिए शुरू हो गया है.
- आटोक्लेव या विच्छेदन के दिन पर विच्छेदन उपकरण जीवाणुरहित करने के लिए, 70% इथेनॉल में 20 मिनट के लिए उपकरण विसर्जित.
भाग 2: चिकी भ्रूण के विच्छेदन (वीडियो पर प्रदर्शन)
- कम से कम 30 सेकंड के लिए एक 70% इथेनॉल स्प्रे के साथ incubated अंडे गीले और उन्हें सावधानी से साफ नरम कागज तौलिये के साथ जब जरूरत से ज्यादा नहीं मिलाते हुए अंडे सूखी.
नोट: हम विदारक एक साथ 60 से अधिक लड़की भ्रूण करने की सलाह देते हैं. - अंडे ध्यान से एक तेज धार के खिलाफ तेज और ओपन सावधानी के साथ भ्रूण ले जर्दी बोरी या लड़की भ्रूण में ही नष्ट नहीं.
- जल्दी नाल गर्भनाल के शुरुआत के लिए खोज और जर्दी बोरी या किसी भी थोड़ा जहाजों को नष्ट किए बिना स्पष्ट लपेटन खुला. फिर सटीक साफ संदंश के साथ गर्भनाल टुकड़े करना.
- भ्रूण की जर्दी बोरी के बाहर ले जाओ.
नोट: भ्रूण जल्दी decapitated (वीडियो में नहीं दिखाया गया है) किया जाना चाहिए. - न्यूनतम आवश्यक माध्यम से 4 बजे भ्रूण लीजिए डिग्री सेल्सियस
भाग 3: चिकी भ्रूण की थकावट
- 60 एमएल बाँझ सिरिंज के बाहर सवार लो.
- एक 60 एमएल सिरिंज में लगभग 10 भ्रूण स्थानांतरण.
- गोताख़ोर सिरिंज में सावधानी से वापस रखो क्रम में macerated सामग्री को खोने जोखिम नहीं है.
- सवार नीचे धकेलने के द्वारा सिझाना.
- तैयार Corning DMEM के साथ 01:01 के अनुपात (: DMEM macerated मास) में आधे भरे ट्यूब में macerated जन लीजिए. 10 भ्रूण लगभग 25 एमएल की एक मात्रा का उपयोग का उत्पादन किया है.
- एक प्रकार के बरतन में 45 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस पर के लिए मिश्रण प्लेस
भाग 4: चिकी भ्रूण के centrifugation - DMEM सस्पेंशन
- लड़की भ्रूण स्थानांतरण - centrifugation ट्यूब में DMEM निलंबन.
- भ्रूण के 25 मिलीग्राम प्रति 1 मिलीग्राम की एकाग्रता में बाँझ hyaluronidase जोड़ें.
- धड़ा centrifugation ट्यूब बहुत ठीक.
नोट: यह कदम सावधानी के साथ किया जाना चाहिए centrifugation के रूप में बहुत उच्च छ बल और सामग्री या अपकेंद्रित्र अगर असंतुलित ट्यूबों का उपयोग हो सकता है के नुकसान पर चलाया जाता है . एक उच्च सटीकता मशीन अनुसार तीन स्थानों के बाद सभी ट्यूबों के लिए दशमलव बिंदु DMEM के साथ लापता राशि का समायोजन करके प्राप्त किया जाना चाहिए के बारे में वजन के साथ. - 4 करने के लिए अपकेंद्रित्र के तापमान में कमी ° सी.
नोट: इसके अलावा centrifugation रोटर एक ठंडा या रात से अधिक कक्ष फ्रिज में संग्रहीत किया जाना चाहिए . - 180.000 xgx एच. के लिए कम से कम 6 घंटे अपकेंद्रित्र नोट: एकल चरणों की जुदाई के बारे में बेहतर परिणामों के लिए उपयोग 266.000 xgx एच. यदि संभव हो तो, निर्वात समायोजन का उपयोग करें.
भाग 5: चिकी भ्रूण निकालें का निस्पंदन
Centrifugation के बाद, तीन चरणों देखा जा सकता है: ऊपरी फैटी टुकड़े, बीच में साफ तरल चरण और centrifugation ट्यूब के नीचे गोली के साथ गंदे तरल चरण नोट: हिलती या centrifuged मिश्रण के तेज चलती हो गया है . कड़ाई से परहेज है, के रूप में यह स्पष्ट केंद्रीय तरल चरण खोने से centrifugation कदम के परिणाम को नष्ट करेगा.
नोट: सभी निम्न चरणों को बाँझ एक लामिना हवा का प्रवाह बेंच का उपयोग करने की शर्तों के तहत प्रदर्शन किया है:
- 0.45 सुक्ष्ममापी के pores के साथ एक फिल्टर प्रणाली में तरल चरण स्पष्ट पिपेट. तब जुड़ा वैक्यूम पंप पर स्विच.
नोट: नीचे में गोली स्पर्श मत करो. यह निकालने और फिल्टर प्रणाली की एक रुकावट के संदूषण के लिए नेतृत्व करेंगे. - 0.22 सुक्ष्ममापी और फिर से जुड़ा वैक्यूम पंप पर स्विच pores के साथ एक फिल्टर प्रणाली में पूर्व निकालने स्थानांतरण.
- प्राप्त लड़की भ्रूण निकालने विभाज्यबाँझ 15 एमएल Corning नलियों में.
- जल्दी -80 पर aliquots दुकान डिग्री सेल्सियस (-62 ° एफ). नोट: दो साल के लिए पिछले CEE यदि -80 पर संग्रहीत डिग्री सेल्सियस
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Discussion
यह प्रोटोकॉल है कि अतीत 10,11 में वर्णित किया गया है प्रक्रियाओं के संशोधनों पर आधारित है. पूर्व प्रकाशन के लिए इसके अलावा में हम यहाँ व्यक्ति की प्रक्रिया के विभिन्न चरणों और अधिक विस्तार दिखाते हैं. यह महत्वपूर्ण विवरण के साथ सही कार्यवाही और विश्वसनीय परिणामों को आश्वस्त experimenter का समर्थन करता है. इसके अलावा, के रूप में विच्छेदन की प्रक्रिया CEE निकासी का एक अनिवार्य हिस्सा है कि हम भ्रूण बाहर ले हर विस्तार में जर्दी बोरी की प्रक्रिया का वर्णन. वहाँ कई महत्वपूर्ण बिंदुओं ध्यान दें के रूप में नीचे चर्चा कर रहे हैं.
लड़की भ्रूण की विच्छेदन के रूप में के रूप में जल्द से जल्द शुरू किया जाना चाहिए ऊष्मायन के बाद समाप्त हो गया है. विच्छेदन के लिए पहले मृत भ्रूण एंजाइमी सक्रियण और प्रोटीन गिरावट के रूप में इस प्रोटोकॉल के किसी भी कदम के लिए प्रयोग नहीं किया जा परिणाम पर प्रतिकूल प्रभाव हो सकता है चाहिए.
इससे पहले कि कुछ हाथ पर प्रशिक्षण विच्छेदन की प्रक्रिया के सभी चरणों के रूप में प्रदर्शन किया जाना चाहिए से बाहर किया जा तेजी से और सही है. शुरू हो रही यह पूरी प्रक्रिया की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है, जो नकारात्मक हस्तक्षेप प्रोटीन की एक उल्लेखनीय राशि के साथ किया गया था करने के लिए अंडे की जर्दी के साथ संदूषण से बचने के. बाद भ्रूण जर्दी बोरे से बाहर ले जाया गया, वे जल्दी से decapitated (वीडियो में नहीं दिखाया गया है) किया जाना चाहिए.
रोटर के रूप में अच्छी तरह के रूप में ज्लदी तापमान भी बहुत महत्वपूर्ण हैं,. आदेश में enzymatic सक्रियण और NCSCM के लिए आवश्यक कारकों की गुणवत्ता और मात्रा की कमी से बचने के लिए अपकेंद्रित्र और रोटर के तापमान 4 से कम किया जाना चाहिए डिग्री सेल्सियस Centrifugation कदम के बाद स्पष्ट केंद्रीय तरल चरण महत्वपूर्ण NCSCM के लिए आवश्यक वृद्धि कारकों से युक्त पूर्व निकालने है. विभिन्न भागों की एक काफी जुदाई और कारकों की एक संवर्धन हासिल करने के लिए हम एक ज्लदी जरूरत से कम 180.000 xgx एच. अनुशंसा नहीं
साफ तरल और centrifugation ट्यूब के शीर्ष पर गंदे तरल चरण चरण के बीच घनत्व में अंतर के रूप में दो भागों में किसी भी मिलाते से बचा जा remixing नहीं रोकता है. गंदे तरल चरण के घटक 0.45 सुक्ष्ममापी फिल्टर प्रणाली के माध्यम से नहीं किया जा filtrated, के रूप में इसे का फैटी भागों बहुत जल्द ही फिल्टर प्रणाली के एक clogging के लिए नेतृत्व करेंगे कर सकते हैं. पर गोली इसके अलावा अपकेंद्रित्र के नीचे सब पर छुआ तक नहीं करना चाहिए, के रूप में के कुछ हिस्सों फिल्टर प्रणाली के clogging नेतृत्व करेंगे.
अंतिम चरण में NCSCs की खेती के लिए CEE की क्षमता के लिए मान्य हो गया है. स्टेम सेल के इस multipotent क्षणिक आबादी होने के पर्याप्त उत्पादन CEE जोडी बिना मीडिया में अपने व्यवहार्यता तेजी से खो देता है. इसलिए एक ट्रांसजेनिक माउस (JoMa1) लाइन है, जो एक transgene गतिविधि पर निर्भर तरीके में जल्दी NCSC मार्करों व्यक्त किया और NCSC जीव विज्ञान का अध्ययन किया जाता है 10 CEE के हर नव प्राप्त आरोप में खेती की जाती है. NCSCs की सफल खेती CEE के एक उचित सत्यापन का प्रतिनिधित्व करता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
और Markus Pajtler और रॉबर्ट Bohrer के समर्थन सलाह इस प्रोटोकॉल के दृश्य के लिए अमूल्य थे.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 11 days incubated chicken eggs | Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH | ||
| Alcoholic disinfection spray | Schülke Mayr GmbH | ||
| DMEMGlutamax | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Syringe sterile (60 ml) | BD Biosciences | ||
| Tubes sterile (50; 15 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Pipet tips sterile | Starlab GmbH | ||
| Hyaluronidase typeIV-S | Sigma-Aldrich | ||
| Milipore stericups sterile (0.45; 0.22 μl) | Fisher Scientific | ||
| Pipettes sterile (25; 10; 5 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Centrifuge L5-50 | Rotor type Ti-45 |
References
- Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. Cell lineage analysis reveals multipotency of some avian neural crest cells. Nature. 335, 161-164 (1988).
- Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
- Rao, M. S., Anderson, D. J. Immortalization and controlled in vitro differentiation of murine multipotent neural crest stem cells. J Neurobiol. 32, 722-746 (1997).
- Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling. Cell. 128, 3949-3961 (2001).
- Kim, J., Lo, L., Dormand, E., Anderson, D. J. SOX10 maintains multipotency and inhibits neuronal differentiation of neural crest stem cells. Neuron. 38, 17-31 (2003).
- Anderson, D. J., Groves, A., Lo, L., Ma, Q., Rao, M., Shah, N. M., Sommer, L. Cell lineage determination and the control of neuronal identity in the neural crest. Review Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 62, 493-504 (1997).
- Dorsky, R. I., Moon, R. T., Raible, D. W. Environmental signals and cell fate specification in premigratory neural crest. Review Bioessays. 22, 708-716 (2000).
- Sieber-Blum, M. Factors controlling lineage specification in the neural crest. Int Rev Cytol. 197, 1-33 (2000).
- Dupin, E., Real, C., Ledouarin, N. The neural crest stem cells: control of neural crest cell fate and plasticity by endothelin-3. Int Rev Cytol. 73, 533-545 (2001).
- Maurer, J., Fuchs, S., Jäger, R., Kurz, B., Sommer, L., Schorle, H. Establishment and controlled differentiation of neural crest stem cell lines using conditional transgenesis. Differentiation. 75, 890-891 (2007).
- Wu, Y. Y., Mujtaba, T., Rao, M. S. Isolation of stem and precursor cells from fetal tissue. Methods Mol Biol. 198, 29-40 (2002).
