Summary
Pour cultiver des cellules souches neurales de crête (NCSC) in vitro, un milieu spécial (NCSCM) est nécessaire. Partie essentielle de NCSCM est extrait d'embryon de poulet (PECO). Nous décrivons ici les techniques précises pour produire une quantité maximisée de qualité pure et de haute PECO, y compris des détails comme l'isolement, la macération, la centrifugation et la filtration.
Abstract
La crête neurale provient de la neuro-ectoderme cours de l'embryogenèse et persiste seulement temporairement. Les premières expériences déjà épreuve cellules progénitrices pluripotentes à être une partie intégrante de la crête neurale 1. Phénotypiquement, les cellules souches neurales de crête (NCSC) sont définis par exprimant simultanément p75 (bas-affine récepteur du facteur de croissance nerveuse, LNGFR) et SOX10 pendant leur migration de la crête neurale 2,3,4,5. Ces cellules progénitrices peuvent se différencier en cellules musculaires lisses, cellules chromaffines, neurones et cellules gliales, ainsi que les mélanocytes, les cartilages et les os 6,7,8,9. Pour cultiver NCSC in vitro, une moyenne spéciale cellules de la crête neurale tige (NCSCM) est requise 10. La partie la plus complexe de la NCSCM est la préparation d'extrait d'embryon de poulet (PECO) qui représente une source essentielle de facteurs de croissance pour le NCSC ainsi que pour d'autres types d'explants de neurones. Autres ingrédients NCSCM côté PECO sont disponibles commercialement. Produire du CCE de laboratoire utilisant un équipement standard, il est de grande importance pour connaître les détails difficiles que l'isolement, la macération, la centrifugation et la filtration. Dans ce protocole, nous décrivons des techniques précises pour produire une quantité maximisée de qualité pure et de haute PECO.
Protocol
Les auteurs indiquent que les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les Communautés européennes la directive du Conseil (86/609/CEE), suivant les directives du NIH concernant les soins et l'utilisation d'animaux pour des procédures expérimentales et les règlements énoncés par le comité institutionnel soin et l'utilisation comité (IACUC) à l'Université de Duisburg-Essen (Allemagne).
Partie 1: Configuration (non montré sur la vidéo)
PRÉPARATION DES MATÉRIAUX ET SOLUTIONS (avant de prendre les oeufs de l'incubateur)
- Les œufs ont à incuber dans un incubateur humidifié pendant 11 jours à 37 ° C (100 ° F).
- De pulvérisation d'éthanol à 70%, des assiettes propres, précis pince propre, 4 ° C (40 ° F) à froid stérile DMEM sur la glace et 60 ml seringues stériles
- 50 ml stériles tubes Corning doivent être à moitié rempli avec 4 ° C à froid DMEM à mélanger les embryons macérés dans un rapport de 1:1 (en masse macérée: DMEM). Dès que les œufs sont sortis de l'incubateur de la dissection des embryons de poussins doit être démarré.
- Stériliser les outils de dissection à l'autoclave ou le jour de la dissection, immerger les outils dans l'éthanol 70% pendant 20 minutes.
Partie 2: Dissection de l'embryons de poulet (montré sur la vidéo)
- Mouiller les oeufs incubés avec un spray d'éthanol à 70% pendant au moins 30 secondes et les sécher soigneusement avec du papier absorbant propre molle tout en ne serrant les oeufs de façon excessive.
Note: Nous recommandons de ne pas disséquer plus de 60 embryons de poulet simultanément. - Ouvrez les oeufs avec soin par s'écrasant sur un bord tranchant et sortir l'embryon avec prudence ne pas détruire le sac jaune ou l'embryon de poulet lui-même.
- Recherche pour le début du cordon ombilical et rapidement ouvert l'emballage claires sans détruire le sac vitellin ou tout petits vaisseaux. Puis décortiquer le cordon ombilical avec une pince précise propre.
- Prenez l'embryon hors du sac jaune.
Remarque: Les embryons doivent être décapité rapidement (pas montré dans la vidéo). - Recueillir les embryons dans un milieu essentiel minimal à 4 ° C.
Partie 3: Macération des embryons de poulet
- Prenez le piston d'une seringue stérile de 60 ml.
- Transférer environ 10 embryons dans un 60 mL.
- Remettre le piston attentivement dans la seringue afin de ne pas risquer de perdre les produits de macération.
- Laisser macérer en appuyant sur le piston.
- Recueillir la masse macérée dans les tubes Corning préparés à moitié rempli avec du DMEM à un ratio de 1:1 (en masse macérée: DMEM). En utilisant 10 embryons un volume d'environ 25 ml est produite.
- Placer le mélange sur un agitateur pendant 45 min à 4 ° C.
Partie 4: La centrifugation de l'embryon de poulet - Suspension du DMEM
- Transfert l'embryon de poulet - la suspension du DMEM dans les tubes de centrifugation.
- Ajouter hyaluronidase stérile à une concentration de 1 mg par 25 mg d'embryon.
- Tare des tubes de centrifugation très précisément.
Note: Cette étape doit être effectuée avec prudence que la centrifugation est géré au G-Force très élevée et des dommages matériels ou centrifugeuse pourrait se produire si l'aide de tubes déséquilibré. Avec une précision de pesage de haute selon la machine sur les trois positions après la virgule pour tous les tubes doivent être reçus en ajustant le montant manquant avec du DMEM. - Réduire la température de la centrifugeuse à 4 ° C.
Remarque: outre le rotor de centrifugation doivent être stockés dans une chambre de refroidissement ou d'un réfrigérateur pendant la nuit. - Centrifugeuse 6 heures au moins pour 180.000 XGX h. Note: Pour de meilleurs résultats concernant la séparation des phases à usage unique 266,000 XGX h. Si possible, utilisez le réglage vide.
Partie 5: filtration de l'extrait d'embryon de poulet
Après la centrifugation, trois phases peuvent être remarqué: La phase supérieure miteux liquide avec des fragments de gras, la phase liquide clair au milieu et le culot au fond du tube de centrifugation. Remarque: Secouer ou le déplacement rapide du mélange doit être centrifugé strictement évités, car cela détruirait le résultat de l'étape de centrifugation en perdant la phase liquide clair central.
Note: Toutes les étapes suivantes doivent être effectuées en conditions stériles sous un banc de flux d'air laminaire:
- Pipeter la phase liquide clair dans un système de filtre avec des pores de 0,45 um. Puis passer à la pompe à vide connectée.
Note: Ne pas toucher le culot au fond. Cela conduirait à une contamination de l'extrait et un blocage du système de filtration. - Transvaser l'extrait pré-dans un système de filtre avec des pores de 0,22 um et l'interrupteur sur la pompe à vide reliée à nouveau.
- Aliquoter l'extrait d'embryon de poulet atteintdans les stériles de 15 mL tubes Corning.
- Stocker rapidement les aliquotes à -80 ° C (-62 ° F). Note: La dernière pour aller jusqu'à deux ans PECO s'il est conservé à -80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ce protocole est basé sur les modifications de procédures qui ont été décrites dans le passé, 10,11. En plus des publications anciennes, nous montrent ici les différentes étapes différentes du processus plus étendu. Cela soutient l'expérimentateur avec des détails importants assurant une procédure correcte et des résultats fiables. En outre, comme le processus de dissection est une partie essentielle de l'extraction de l'ECO, nous décrivons la procédure de prise des embryons hors du sac jaune dans chaque détail. Il ya plusieurs points importants à noter que discuté ci-dessous.
La dissection des embryons de poussins doit être démarré dès que possible après l'incubation est terminée. Les embryons étant morts avant la dissection ne doit pas être utilisé pour toute les étapes de ce protocole que l'activation enzymatique et de la dégradation des protéines pourraient influencer négativement le résultat.
Avant de commencer une main-sur la formation doit être effectuée que toutes les étapes du processus de dissection doivent être réalisées rapidement et avec précision. Il est important pour la réussite de toute la procédure, pour éviter toute contamination avec le jaune d'oeuf qui a été accompagnée par une quantité notable de protéines interférant négativement. Après les embryons ont été sortis des sacs jaunes devraient être décapités rapidement (pas montré dans la vidéo).
Température ainsi que la célérité du rotor sont très importants, aussi. Afin d'éviter l'activation enzymatique et une diminution de la qualité et la quantité des facteurs nécessaires à la NCSCM la température de la centrifugeuse et le rotor doit être réduite à 4 ° C. Après l'étape de centrifugation la phase liquide clair central est le préalable importante extrait contenant les facteurs de croissance essentiel pour l'NCSCM. Pour obtenir une séparation considérable des différentes fractions et un enrichissement des facteurs nécessaires, nous recommandons une célérité pas inférieure à 180.000 XGX h.
Comme la différence de densité entre la phase liquide clair et la phase liquide terne au sommet du tube de centrifugation n'empêche pas un remixage des deux parties tout en secouant doit être évitée. Les composants de la phase liquide ne peut être terne filtrée à travers un système de filtre à 0,45 pm, comme les parties grasses de celui-ci serait très vite conduire à un engorgement du système de filtrage. Aussi le culot au fond de la centrifugeuse ne doit pas être touché à tout, comme des parties d'elle conduirait à colmatage du système de filtration.
Dans une dernière étape du potentiel de l'Europe centrale et orientale pour la culture de SNCLC doit être validé. Cette population multipotentes transitoire de cellules souches perd sa viabilité rapidement dans les médias sans avoir ajouté adéquats produit PECO. Par conséquent, une lignée de souris transgéniques (JoMa1), qui exprime les marqueurs début NCSC de manière transgène activité dépendante et est utilisée pour étudier la biologie NCSC est cultivé dans toutes les charges nouvellement obtenus de l'ECO 10. La culture du succès SNCLC représente une validation appropriée de l'Europe centrale et orientale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Le soutien et les conseils de Markus et Robert Pajtler Bohrer ont été inestimables pour la visualisation de ce protocole.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 11 days incubated chicken eggs | Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH | ||
| Alcoholic disinfection spray | Schülke Mayr GmbH | ||
| DMEMGlutamax | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Syringe sterile (60 ml) | BD Biosciences | ||
| Tubes sterile (50; 15 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Pipet tips sterile | Starlab GmbH | ||
| Hyaluronidase typeIV-S | Sigma-Aldrich | ||
| Milipore stericups sterile (0.45; 0.22 μl) | Fisher Scientific | ||
| Pipettes sterile (25; 10; 5 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Centrifuge L5-50 | Rotor type Ti-45 |
References
- Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. Cell lineage analysis reveals multipotency of some avian neural crest cells. Nature. 335, 161-164 (1988).
- Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
- Rao, M. S., Anderson, D. J. Immortalization and controlled in vitro differentiation of murine multipotent neural crest stem cells. J Neurobiol. 32, 722-746 (1997).
- Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling. Cell. 128, 3949-3961 (2001).
- Kim, J., Lo, L., Dormand, E., Anderson, D. J. SOX10 maintains multipotency and inhibits neuronal differentiation of neural crest stem cells. Neuron. 38, 17-31 (2003).
- Anderson, D. J., Groves, A., Lo, L., Ma, Q., Rao, M., Shah, N. M., Sommer, L. Cell lineage determination and the control of neuronal identity in the neural crest. Review Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 62, 493-504 (1997).
- Dorsky, R. I., Moon, R. T., Raible, D. W. Environmental signals and cell fate specification in premigratory neural crest. Review Bioessays. 22, 708-716 (2000).
- Sieber-Blum, M. Factors controlling lineage specification in the neural crest. Int Rev Cytol. 197, 1-33 (2000).
- Dupin, E., Real, C., Ledouarin, N. The neural crest stem cells: control of neural crest cell fate and plasticity by endothelin-3. Int Rev Cytol. 73, 533-545 (2001).
- Maurer, J., Fuchs, S., Jäger, R., Kurz, B., Sommer, L., Schorle, H. Establishment and controlled differentiation of neural crest stem cell lines using conditional transgenesis. Differentiation. 75, 890-891 (2007).
- Wu, Y. Y., Mujtaba, T., Rao, M. S. Isolation of stem and precursor cells from fetal tissue. Methods Mol Biol. 198, 29-40 (2002).
