Summary
المشبك hyperinsulinemic سوي سكر الدم ، هي "المعيار الذهبي" لتقييم عمل الانسولين. هي التي غرست الأنسولين بمعدل ثابت تحفيز امتصاص الجلوكوز. كمية الجلوكوز الخارجية التي غرست لمواجهة هذا الانخفاض هو دليل على حساسية الانسولين. هنا يتم تنفيذ الإجراء على الفئران ، واعية غير المقيد.
Abstract
السكري من النوع 2 (T2D) يتزايد تزايدا سريعا في الانتشار. تميزت إما عدم كفاية إنتاج الأنسولين أو عدم القدرة على الاستفادة من الأنسولين المنتج ، والنتائج T2D في ارتفاع مستويات السكر في الدم. "الذهب القياسية" في تقييم الحساسية للانسولين هو المشبك سوي سكر الدم ، أو hyperinsulinemic المشبك الانسولين. في هذا الإجراء ، هي التي غرست الأنسولين بمعدل ثابت أدى إلى انخفاض في مستوى السكر في الدم. للحفاظ على مستوى السكر في الدم عند مستوى ثابت ، هي التي غرست الجلوكوز الخارجية (D50) إلى الدورة الدموية الوريدية. كمية الجلوكوز التي غرست في الحفاظ على التوازن يدل على حساسية الانسولين. هنا ، نظهر الإجراء المشبك الأساسية في مقسطر مزمنة ، الفئران ، غير المقيد واعية. هذا النموذج يسمح جمع الدم مع التشديد على الحد الأدنى من الحيوان. بعد التخدير ، يتم إجراء شق خط الوسط واليسار مقسطر الشريان السباتي المشترك وحبل الوريد الصحيح. يتم مسح إدخال القسطرة مع heparinized المالحة ، ثم exteriorized والمضمون. مسموح للحيوانات لاسترداد 4-5 أيام قبل التجارب ، مع زيادة الوزن مراقبتها يوميا. تستخدم فقط تلك الحيوانات تستعيد الوزن الذي لمستويات ما قبل الجراحة لإجراء التجارب. في يوم من التجربة ، وصام الفئران وتوصيلها الى المضخات التي تحتوي على الانسولين وD50. ويتم تقييم الجلوكوز من خط الأساس الشرايين ويستخدم معيارا في كافة مراحل التجربة (سوائية سكر الدم). بعد هذا ، هي التي غرست الأنسولين بمعدل ثابت إلى الدورة الدموية الوريدية. لتتناسب مع انخفاض في نسبة السكر في الدم ، هي التي غرست D50. إذا كان معدل ضخ D50 أكبر من معدل امتصاص ، وارتفاع في نسبة الجلوكوز تحدث. وبالمثل ، إذا كان معدل غير كافية لامتصاص الغلوكوز تطابق كامل الجسم ، وسوف يحدث انخفاض. المعايرة من الجلوكوز تستمر حتى يتم تحقيق قراءات الجلوكوز مستقرة. وتسجل مستويات الغلوكوز ومعدلات ضخ الجلوكوز خلال هذه الفترة استقرارا والإبلاغ عنها. النتائج توفر فهرس كامل الجسم حساسية الانسولين. ويمكن صقل هذه التقنية لتلبية متطلبات محددة التجريبية. وتعزز ذلك عن طريق استخدام استشفاف المشعة التي يمكن تحديد الأنسجة للأنسولين محددة حفزت امتصاص الغلوكوز وكذلك دوران كامل الجسم الجلوكوز.
Protocol
ج : القسطرة الجراحية للتداول الشرياني والوريدي
الجزء 1 : الشرياني والوريدي إعداد قسطرة
- قطع 15 سم من PE - 50 (قطرها الداخلي 0.58 مم (0.023 ") × يبلغ قطرها الخارجي من 0.965 ملم (0.038"). قص مقطع من أنبوب 1MM silastic (0.76mm (0.030 ") وقطرها الداخلي خ 1.65mm (0.065 ") القطر الخارجي) لاستخدامها كعامل كبح حبة. وحبة تقييدي يمنع الفئران من سحب القسطرة مرة واحدة هو في مكانه.
- إدراج نصائح الصغرى ملقط تشريح في التجويف من حبة الزجرية وعقد بلطف نصائح من ملقط لتمتد بعيدا في الانفتاح بشكل اوسع. زوج آخر من استخدام الملقط تشريح الصغيرة ، الشريحة الأنبوب silastic في التجويف من حبة زجرية. آمنة مع الغراء اللاصق القوي (وكتايت سوبر الغراء). يجب أن حبة شقة تقع في مختلف أنحاء القسطرة. السماح ليجف القسطرة (24H).
- لفأر غرام 300 ، السطر هو الشريان ~ 2.7cm من حبة زجرية في حين أن خط الوداجي هو ~ 3.2cm. ويتم تعديل أطوال القسطرة من تقييد بواسطة 0.5cm لكل 100G زيادة في وزن الجسم. لا شطبة حواف القسطرة لأن هذا قد ثقب السفينة أثناء الإدراج.
- مباشرة قبل الجراحة ، وملء خطوط المياه المالحة مع heparinized (10U/ml) ، وختم كلا طرفي مع المكونات من الصلب غير القابل للصدأ الأنابيب ومكان في الإيثانول (70 ٪) لتعقيم. الهواء الجاف قبل الإدراج.
الجزء 2 : إعداد الجراحية
- تمت الموافقة على الإجراءات المتبعة في جامعة كالغاري رعاية الحيوان واستخدام اللجنة وتلتزم الرابطة theCanadian مبادئ توجيهية مختبر علوم الحيوان لاجراء التجارب. تم تنفيذ الإجراءات المذكورة أدناه على والكبار الفئران سبراغ داولي الذكور (~ 300g). يتم تنفيذ كافة الإجراءات في إطار isoflurane ، على الرغم من أنه من الممكن استخدام المخدر عن طريق الحقن. يتم تنفيذ كافة العمليات الجراحية ضمان تقنيات العقيم. يتم تعقيم تعقيم المعدات الجراحية ، والأكواب heparinized المالحة. يتم شراؤها تعقيم القفازات الجراحية والحقن والقطن يميل تطبيقها من المورد.
- وزن الفئران وتسجيل النتيجة. سوف يكون من المهم الوزن في رصد مرحلة ما بعد العمليات الجراحية للحيوانات. وينبغي أن تستخدم الحيوانات الوحيدة التي لاستعادة الوزن قبل الجراحة المستويات من أجل التجريب. تخدير الفئران (3 ٪ isoflurane) في المربع مخدر. الحفاظ على الفئران في ~ 2 ٪ isoflurane أثناء الجراحة باستخدام مخروط الأنف. ويجب إجراء عملية جراحية في منطقة تطهيرها تعزز عقامة.
- اعداد هذا الحيوان عن طريق إزالة الشعر من موقع الجراحية (العنق والكتف). ويمكن استخدام مقص شعر صغير أو مزيل الشعر الكيميائية. تنفيذ هذا الإجراء في منطقة منفصلة من حيث الجراحة التي ستجرى.
- الحيوانية لتأمين طاولة الجراحة. ضمان تخدير الحيوان بالكامل عن طريق التحقق من وجود القدم / العين ردود الفعل. إعداد مواقع الجراحية مع مطهر الجلد المناسب (الإيثانول 70 ٪ يليها فرك betadine تليها الايثانول 70 ٪).
الجزء 3 : جراحة
- جعل شق صغير خط الوسط العمودي 1cm متفوقة على القص (التقط الجلد طوليا على طول محور وسطي مع ملقط وقطع مع مقص أو مشرط).
- تشريح كليل باستخدام الملقط الصغير تشريح العضلات لفضح القصي الخشائي اليسار. وتعكس هذه العضلة لفضح 1cm ما يقرب من الشريان السباتي الأيسر. استخدام ملقط تشريح الصغرى تحت الشريان السباتي لعقد الشريان في مكانها. ندف بلطف النسيج الضام من الشريان السباتي. من المهم عزل العصب المبهم من الشريان دون الإضرار إما الشريان أو العصب. ثم عزل الشريان ligate نهاية رأسيا مع خياطة الحرير 4-0 (سوف تستخدم لمعالجة هذا الشريان السباتي أثناء الجراحة). ملاحظة : يجب تعقيم الغرز 4-0 الايثانول مع 70 ٪ قبل استخدامها.
- المشبك السفينة مع مسننة ، ملقط تشريح الصغرى. ثقب في نهاية ligated مع محول قياس 21 Luer VENOJECT نموذج متعدد. إزالة أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ والمكونات بعناية ادخال قسطرة مع المعونة من introducer القسطرة العقيمة أن نعترف أنه في الشريان. ضمان القسطرة آمنة بالملقط ، وإطلاق سراح جزئيا الدقيقة ملقط تشريح الشريان لقط ومواصلة ادخال قسطرة للحبة. عند هذه النقطة ، ينبغي للطرف القسطرة تكون في قوس الأبهر. الحرص على عدم الافراج عن القسطرة ، والضغط على السفينة بالقوة بها.
- التعادل 4-0 two الغرز بشكل آمن دون حبة واحدة أعلاه ، وتأكيد أن القسطرة سوف العينة. تماشيا مع تدفق المياه المالحة heparinized 10U/ml. إعادة توصيل الطرف الخارجي للقسطرة مع المكونات أنابيب الصلب المقاوم للصدأ.
- باستخدام شق نفسه ، كشف تشريح فظة الحق الوريد الوداجي الخارجي. عزل بعناية وligate نهاية رأسيا مع خياطة الحرير. بزل الوريد مع محول قياس 21 Luer VENOJECT نموذج متعدد. إزالة أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ والمكونات ادخال قسطرة العقيمة مع جintroducer atheter لخياطة الجروح وربطة عنق two حبة حبة تحت. ربطة عنق خياطة الثالثة أعلاه حبة ويؤكد أنه العينات. تدفق مع خط وريدي 10U/mL heparinized المالحة. إعادة توصيل نهاية القسطرة الخارجية مع الفولاذ المقاوم للصدأ الأنابيب المكونات.
- نفق 14 عيار إبرة حادة تحت الجلد وجعل شق في الظهر بين لوحي الكتف. الخيط القسطرة من خلال إبرة لexteriorize لهم في الجزء الخلفي من الفئران. 4cm تقريبا من خط واضح. قطع الأنابيب من 0.5cm Tygon الطبية S - 50 - HL ، وضعه حول القسطرة كل exteriorized وآمن مع الشريط (الأزرق لالوريد ، الشريان الأحمر ل) المطلوبة. heparinized إعادة اختبار القسطرة لضمان المباح ، وملء مع تدفق 150U/ml المالحة لمنع تخثر الدم.
- إغلاق جميع الفتحات مع خياطة الحرير 3-0. الفئران المعرضة للمكان ، في القفص ، قبل تحسنت نظيفة مع الغذاء في الجزء السفلي من القفص.
باء : رعاية ما بعد الجراحة
الجزء 1 : رعاية ما بعد الجراحة العاجلة والرصد
- بمجرد أن تستعيد قدرة الفئران المتنقلة اليقظة الكاملة وإرجاع الفئران في السكن الحيوانية.
- السماح للفئران لاستعادة لمدة 3-5 أيام.
- رصد يومي للألم ، والعدوى والتغيرات في الوزن. قد تكون العدوى للقلق إذا لوحظ من مواقع التفريغ شق والخمول العامة و / أو ألم. يشار الألم عن طريق التقوس في الجلوس ، تكدرت الفراء الظهر وغياب السلوك المتنقلة و / أو تناول الطعام. قد يكون من ذوي الخبرة في خسارة الوزن بعد الجراحة مباشرة تصل إلى ثلاثة أيام بعد الجراحة ، ومع ذلك ، يجب تحقيق الاستقرار في الوزن و / أو زيادة في حدود 10 ٪ من الوزن قبل الجراحة في غضون 5 أيام. قد تشير إلى فقدان الوزن الشديد العدوى ، والسكتة الدماغية و / أو ألم.
- إعادة اختبار القسطرة يوميا لضمان سالكية.
الجزء 2 : الحفاظ على الإنفتاح قسطرة
- كل يوم خلال فترة ما بعد المرجع الانتعاش ، وملء المحاقن 1ml تلميح زلة مع المالحة heparinized 150U/ml وقبعة مع إبرة قياس 22 حادة. يتم إدخال إبرة حادة في 20cm PE من 50 أنابيب قياس 23 مع الفولاذ المقاوم للصدأ الأنابيب مقرنة في الطرف الآخر.
- إزالة فقاعات الهواء عن طريق وضع نهاية للأنابيب مقرنة أعلى من بقية المحاقن 1ml ودفع فقاعات من على خط المرمى.
- المشبك من على خط المرمى الشرياني تخريجها من الفئران مع المرقأة أقل بقليل من المكونات.
- إزالة المكونات القسطرة الصلب باستخدام الزوج الثاني من المرقأة.
- إدراج مقرنة أنابيب متصلة حقنة في خط الشرايين واطلاق سراح المرقأة غالقة القسطرة الشريانية تخريجها.
- نضح الدم الشرياني لقسطرة في المحاقن. إذا القسطرة لا تضع بسهولة قد يكون من الضروري دفع بلطف شديد في كمية صغيرة من محلول دافق من خلال القسطرة لإخراج غيض من القسطرة في حالة مثبتة ضد جدار الوعاء الدموي. وقد تم تطهيرها تماما القسطرة عندما يصل الدم إلى المحقنة.
- المشبك إغلاق أنابيب PE - 50 المحاقن 1ml إلى والتخلص من المحاقن. استبدال مع حقنة جديدة مليئة المالحة العذبة heparinized 150U/ml. Unclamp الأنبوب وعقد حقنة جديدة تستقيم ، ونفض الغبار عن حقنة جديدة مع ساكنا لطرد أي فقاعات هواء جديد محتمل صعودا وبعيدا عن خط المرمى. ملاحظة : يجب ضمان رعاية وفقاعات الهواء يمكن أن يسبب السكتة الدماغية.
- حقن المياه المالحة 150U/ml heparinzed حتى خط القسطرة واضح وخال من الدم.
- المشبك من على خط المرمى الشرياني تخريجها من الفئران مع المرقأة أسفل مقرنة الأنابيب. إزالة الرابط حقنة من سطر قسطرة الشرايين واستبدالها مع المكونات أنابيب الصلب المقاوم للصدأ.
- الافراج عن المرقأة غالقة القسطرة الشريانية تخريجها.
- تكرار خط وريدي ل. ومع ذلك ، بسبب انخفاض الضغط الوريدي أخذ العينات غالبا ما لا يكون ممكنا. إذا كان من الممكن أن غرست المالحة 150U/ml heparinzed مع الحد الأدنى من المقاومة ومن المحتمل ان يتم وضع جيد للقسطرة في الوريد.
C : Hyperinsulinemic - المشبك سوي سكر الدم
الجزء 1 : تعيين المشبك المتابعة والتحضير
- وزن الفئران وتسجيل الوزن. هذا وسوف تكون هناك حاجة لتحديد معدلات ضخ الانسولين والجلوكوز. سرعة الفئران على الأقل 5H قبل التجربة. وهذا يضمن للحيوان في حالة بعد الأكل ، والتقليل من مساهمة الجلوكوز من المصادر الغذائية. وضع الفئران في حاوية صغيرة / قفص مع الأسرة التي تحد من الحركة المفرطة. ينبغي أن تكون قادرة على الحيوان يستدير والعريس بحرية.
- اقامة خطوط ضخ ومضخات كما رأينا في الشكل 1. P50 أطوال الأنابيب الصدد هي كما يلي : حقنة لموصل Y هو 8cm ، Y الموصل إلى الجرذ 15cm ، 20cm الخط الشرياني والوريدي هو خط 10cm في الطول. إزالة غير القابل للصدأ الأنابيب الصلب والمقابس تدفق خطوط الوداجي والشرايين لضمان ضخ وأخذ العينات على التوالي مع heparinized 10U/ml المالحة.
- تحديد الانسولين حجم المطلوب. هذا وسوف تختلف تبعا لمستوى الانسولين والوزن من الفئران. هنا ، وتدير 4mU/kg/min بمعدل 2uL/min. هذا هو جرعة عالية الفسيولوجية. حيثما كان ذلك ممكنا ، ينبغي بذل محاولات للحد من حجم التسريب. وينبغي أن تضعف الأنسولين بشكل مناسب وتدار في وجود البلازما. ويتم استخدام البلازما الفئران 3 ٪ الحل في المياه المالحة لتخفيف الانسولين في هذا المختبر. الأنسولين هو HumulinR 100U/ml (ايلي ليلي) ، على الرغم من ويمكن استخدام الانسولين الأخرى تتصرف بسرعة. ضمان الانسولين المخفف يختلط جيدا قبل وضع حقنة في التسريب.
- إعداد دكستروز 50 ٪. يمكن وضعها مباشرة في هذه الحقنة على مضخة التسريب. ماركة مضخة مع "الجلوكوز" لتفادي الخلط في المستقبل. تذكر لضمان كميات كافية من الانسولين والجلوكوز للدراسة. المشابك عموما مشاركة ~ 2H. في هذا البروتوكول ، تستخدم المحاقن 3ml.
- مكان الجلوكوز والأنسولين المحاقن النموذجي على جهاز هارفارد 11 زائد مضخات الحقنة. الجلوكوز مسبقا لY - رابط والخط المشبك مع مرقئ. الأنسولين مسبقا على الحيوانات ، وتمشيا مع مرقئ المشبك. المشبك خطوط الفئران والسماح للاسترخاء ل30min قبل بدء التجربة. ملاحظة : اقترح حراس المرقأة غيض من أجل تجنب العقص دائمة للخطوط.
- إعداد أجهزة الطرد المركزي وأنابيب EDTA المغلفة لجمع البلازما. في هذه الدراسة ، سيتم الحصول على عينات دم إضافية واحدة هي فرضت الحيوان.
الجزء 2 : البروتوكول التجريبي
- ينبغي الحصول عليها عينة الأنسولين الأساسي وعينة الهيماتوكريت. الهيماتوكريت أخذ العينات يضمن المحافظة على حجم الدم في كافة مراحل التجربة. عموما ، يجب ألا تقع مستويات الهيماتوكريت أكثر من 10 ٪ من القيمة الأولية.
- الحصول على عينة الجلوكوز الأساس (الترا بلمسة واحدة ، ايفسكان ، المؤتمر الوطني العراقي) ، وتحديد مستوى السكر في الدم كله أن فرضت. هنا ، ونحن في المشبك سوائية سكر الدم ، أو 5.0 و 5.5mm (الشكل 2). بعد كل عينة من الدم ، خط استواء الشرياني مع كمية صغيرة من 10U/ml heparinized المالحة لمنع تخثر الدم. ملاحظة : ضمان عدم وجود جلطات أو فقاعات الهواء هي في السطر قبل غرس. يمكن لهذه الحيوانات تعطي بسكتة دماغية.
- بدء ضخ الانسولين. تأخذ السكر في الدم في فترات 5 - 10min ، ورصد الجلوكوز في كل نقطة زمنية. ضبط معدل السكر في التسريب كما هو مطلوب حتى يتم التوصل إلى حالة مستقرة. هذه العملية هي عادة عملية التجربة والخطأ ، ويمكن أن تتخذ ل30min> 2H. مستويات الجلوكوز اللازم للمحافظة على سكر الدم تعتمد على بروتوكول التجريبية والأنواع والظروف الحالية (الشكل 2).
- مطرد مستويات السكر في الدولة هي ثلاث قراءات متتالية ضمن نطاق محدد. هنا ، يعتبر فرضت ثلاث قراءات في 1MM ~ (مثل 4.8 ، 5.2 ، 5.6mM). متى تم تحقيق حالة مستقرة ، سجل معدل ضخ الجلوكوز اللازم للمحافظة على سكر الدم لمدة 30min. ويمكن خلال هذا الوقت يمكن الحصول على عينات دم إضافية. في الحد الأدنى ، ينبغي الحصول على الانسولين البلازما عينة ثانية وعينة الهيماتوكريت.
- بمجرد اكتمال المشبك ، يمكن أن تستخدم الحيوانات لمزيد من الاختبار او الموت الرحيم والأنسجة التي تم جمعها لمزيد من التحليل. اعتمادا على الحيوان ، ويمكن أن تبقى القسطرة خطوط البراءات لمدة 5-7 أيام.
D : Hyperinsulinemic سوي سكر الدم ، نتائج المشبك (الأنسولين)
عندما يقوم بشكل صحيح ، فإن الإجراء المشبك يقيم الانسولين حالة مستقرة حساسية الفئران. في تقديم البيانات التي تم الحصول عليها من المشبك ، فمن الضروري لتوثيق مستويات الغلوكوز ومعدلات ضخ الجلوكوز. مستويات السكر مستقرة أكثر من دوام وجود الحد الأدنى من 30min (الشكل 3) تدل على حالة مستقرة. يعتبر الجلوكوز مستقرة إلا إذا حافظت كلها السكر في الدم ضمن 1MM ~. معدلات ضخ الجلوكوز تظهر مستويات الجلوكوز الخارجية اللازمة للحفاظ على سكر الدم. حيثما كان ذلك ممكنا ، ينبغي أن تظهر هذه الأرقام بمثابة دوام بدلا من قيمة واحدة في المتوسط (الشكل 4).
غيرها من التدابير الموصى بها ليكون المبلغ عنها الانسولين البلازما والهيماتوكريت. وقد تم تصميم كل من الصيام وفرضت مستويات الانسولين الانسولين تأكيد أن تدار بنجاح ، وسيتم الكشف عن أي اختلافات في مستويات بين مجموعات العلاج (الشكل 5). واقترح اجراءات الحصول على الهيماتوكريت في الأساس وعند الانتهاء من الانسولين المشبك (الشكل 6). هذا هو لضمان مستويات الهيماتوكريت لا تقع أكثر من 5 ٪ خلال التجربة والتغيرات المصاحبة في حجم تدفق الدم والتخلص من النفوذ لا الجلوكوز.
الشكل 1. انشاء التجريبية. الشكل 1 يبين المنفلتة ، الجرذان واعية أثناء إجراء المشبك. القسطرة تسمح اخذ عينات من الدم والحقن الوريدية دون التعامل مع الحيوان. مضخات إلى اليسار تحتوي على الانسولين والجلوكوز.
الشكل 2. البيانات المتوقعة أثناء إجراء المشبك. للحصول على المشبك عند مستويات خط الأساس (سوائية سكر الدم ، 5mM) ، يتم التلاعب في مستويات الجلوكوز الخارجية (D50) حتى يتم تحقيق الأساس أو "المشبك".
الشكل 3. غلوكوز البلازما النتائج المتوقعة من هذا الإجراء المشبك. عندما يتم "فرضت" الحيوان ، والسكر في الدم مستقرة نسبيا عبر الزمن والمجموعات التجريبية.
الشكل 4. الممثل معدلات ضخ الجلوكوز الإجراء المشبك. كمية الجلوكوز الخارجية اللازمة للحفاظ على سوائية سكر الدم يختلف. ويتضح هذا مع التحكم (تشاو فدان) وارتفاع الدهون تغذية (مقاومة الإنسولين) الحيوانات. ارتفاع الدهون الحيوانية يتغذى يتطلب قدرا أقل من السكر للحفاظ على سكر الدم غرست ، في المقام الأول لأنه غير حساس لغرست الانسولين.
الشكل 5. الممثل الانسولين البلازما في الفئران. ينبغي للأنسولين البلازما خلال المشبك الأنسولين تكون أعلى من صام ، والانسولين البلازما خط الأساس. هذا يضمن كانت تدار بشكل صحيح الانسولين للحيوان خلال المشبك الانسولين.
الشكل 6. الإبلاغ الهيماتوكريت. ويجب الحصول على الهيماتوكريت خط الأساس والهيماتوكريت بعد التجربة والإبلاغ عنها. هذا يضمن مستويات الهيماتوكريت لا تقع أكثر من 5 ٪ من مستويات خط الأساس الناتجة عن الإفراط في أخذ عينات من الدم الشرياني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وضعت في البداية للتحقيق في حساسية الانسولين في البشر ، وقد تم الآن إجراء المشبك تتكيف مع الأنواع الأخرى بما فيها الجرذان والفئران المختبرية. النماذج الحيوانية التحقيق في مقاومة الانسولين يقدم مساعدات كبيرة في فهم الفيزيولوجيا المرضية للحساسية والأمراض المرتبطة الأنسولين وكذلك تحديد التدخلات العلاجية التي السريرية 1،2 القيمة. وقد استخدمت عدة طرق لتقييم الحساسية للانسولين لدى الحيوانات 3. هذه التقنيات تشمل الاختلافات اختبارات تحمل الغلوكوز (GTTs) واختبارات التسامح الأنسولين (ITTs) 4-6 ، وكذلك من حساسية الانسولين الفهارس / المقاومة المستمدة من ظروف الحالة المستقرة الصيام 7-9. ومع ذلك ، عندما الحساسية للانسولين هو الهدف الأساسي والجدوى الفنية التجريبية لا يحد من المشبك الأنسولين يبقى المعيار. هنا نقدم الإجراء المشبك الأساسية في الفئران ، واعية غير المقيد. يدار الأنسولين بمعدل ثابت في حين غرست الجلوكوز الخارجية المتغير للحفاظ على سكر الدم. يتم الحصول على الوصول إلى الدورة الدموية للحيوان من خلال زرع القسطرة الشريانية والوداجي. كما نؤكد الحيوانية (معالجة) ، وتدفق الجلوكوز تغيير التخدير والحساسية للانسولين ، ويفضل أن يقلل من نموذج لهذه العوامل والاستفادة منها في هذا الإجراء.
ويشيع استخدام المشبك الانسولين في مرض السكري ، والقلب والأوعية الدموية التحقيقات والصناعات الدوائية. تعديلات على إجراءات تشمل إضافة استشفاف النظائر (المشعة أو ثابت). هذه هي أقوى من حيث أنها تسمح للمحققين لتحديد كيفية تغيير مسارات محددة والأنسجة الحيوية ردا على المشبك. النظائر مشتركة تشمل استخدام 2 -- [14C] - deoxyglucose لفحص الجسم كله ، والتخلص من الأنسجة الجلوكوز محددة وكذلك [3H] - الجلوكوز لقياس تدفق الجلوكوز. مراجعات ممتازة من القضايا المنهجية والإبلاغ عند تنفيذ الإجراء المشبك الانسولين بواسطة اسرمان آخرون ويوصى بشدة 10،11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تمت الموافقة على الإجراءات المتبعة في جامعة كالغاري رعاية الحيوان واستخدام اللجنة والالتزام من قبل الجمعية الكندية لوضع مبادئ توجيهية لمختبر علوم الحيوان التجريب. الكتاب ليس لديهم مصالح متعارضة أو الكشف.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة وCanada.JS الجينوم يحمل جوائز الدعم من الراتب للأبحاث الطبية Foundationfor التراث ألبرتا ، والقلب والسكتة الدماغية من مؤسسة Canadaand جمعية السكري الكندية. شكر خاص للدكتور ديفيد واسرمان Bracy ضربة موفقة لتدريس هذا الإجراء إلى المختبر شيرر.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intramedic Polyethylene Tubing (PE-50) | Fisher Scientific | 14-170-12B | Internal diameter of .58mm (.023") x Outer diameter of .965mm (.038") |
| Dow Corning Silastic Laboratory Tubing | Fisher Scientific | 11-189-15C | Internal diameter of .76mm (0.030") x Outer diameter of 1.65mm (0.065") |
| Tygon S-50-HL Medical Tubing | Harvard Apparatus | PY2 72-1251 | Internal diameter of 3.2mm (0.125") x Outer diameter of 4.7mm (0.1875") |
| Loctite Super Glue | Grand Toy | 32237 | Gel Control |
| Sterile Surgical Blade | VWR international | BD371610 | |
| Curved Micro Dissecting Forceps | George Tiemann & Co. | 160-20 | x 2 |
| Straight Micro Dissecting Forceps | George Tiemann & Co. | 160-15 | x 2 |
| Curved Hemostat | George Tiemann & Co. | 105-1135 | x 2 |
| Straight Hemostat | George Tiemann & Co. | 105-1130 | x 2 |
| Hemostat Tip Guards | Robbins Instruments, Inc. | 15.09-2-004 | |
| Straight Surgery Scissors | George Tiemann & Co. | 105-402 | |
| VENOJECT Multi-Sample Luer Adapter | Terumo Medical Corp. | 810127A | 21 guage, 1 in. |
| Sterile Catheter Introducer | BD Biosciences | 406999 | |
| 14-gauge Blunt Needle | BD Biosciences | 511310 | 14 guage, 2 in. |
| Sterile Surgical Suture | Johnson & Johnson | 1679H | Silk, size 3-0 |
| Non-Sterile Surgical Suture | Angiotech Pharmaceuticals, Inc. | SP116 | Silk, size 4-0 |
| Cotton Swabs | VWR international | 10806-005 | |
| 4ply Gauze Pads | VWR international | CA43845-062 | |
| Small Animal Cordless Clippers | Harvard Apparatus | 729063 | |
| Isoflurane | Halocarbon Products Corp. | IPN-45 | |
| Anesthetic Cart | Benson Medical Instruments | ||
| 70 % Ethanol | Fisher Scientific | HC-1000 | |
| Betadine Antiseptic Solution | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 105267 | |
| Model 11 Plus Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702208 | |
| Stainless Steel Tubing Couplers | Harvard Apparatus | 72-4434 | 23 gauge, 0.3 in. |
| Stainless Steel Tubing Plugs | Harvard Apparatus | 72-4436 | 23 gauge, 0.5 in. |
| Stainless Steel Blunt Needles | Instech Laboratories, Inc | LS22 | 22 gauge |
| 60 Degree Y-Connectors | Small Parts, Inc. | STCY-22-05 | 22 gauge |
| CritSpin Micro-hematocrit Centrifuge | Iris Sample Processing | CS12 | |
| Mini Centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Micro Centrifuge Tubes | VWR international | 53550-778 | |
| 50ml polypropylene centrifuge tubes | VWR international | 89004-364 | |
| 1ml Plastic Slip Tip Syringes | BD Biosciences | 309602 | |
| 3ml Plastic Luerlok Tip Syringes | BD Biosciences | 309585 | |
| Heparin Anticoagulant Injection | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 102824 | Manufacturer: LEO Pharma Inc.Conc. 1000 IU |
| EDTA Solution | Promega Corp. | V4231 | 0.5 M, pH 8.0 |
| Saline | Western Drug Distribution Center, Ltd. | ABB7983154 | Manufacturer: Hospira0.9% Sodium Chloride |
| 50% Dextrose | Vétoquinol | 8DEX012D | |
| Humulin-R | Eli Lilly | HI-210 | 100U/ml |
| 1ml Insulin Syringes | BD Biosciences | 309311 | |
| Fisherbrand* Hemato-Seal Sealant | Fisher Scientific | 02-678 | |
| Fisherbrand* Microhematocrit Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22-362-574 | |
| One Touch Ultra Test Strips | LifeScan, Inc. | AW 085-314H | |
| One Touch Ultra Blood Glucose Meter | LifeScan, Inc. | AW 085-314B | |
| Sodium Pentobarbitol | Ceva Sante Animale | 1715 138 | Conc. 54.7mg/ml |
| Red Laboratory Labeling Tape | VWR international | 89097-932 | |
| Blue Laboratory Labeling Tape | VWR international | 89097-936 | |
| Weigh Scale | Fisher Scientific | 01-913-88 | |
| Vortex | VWR international | 58815-234 | |
| Timer | VWR international | 62344-641 |
References
- Halseth, A. E., Bracy, D. P., Wasserman, D. H. Limitations to basal and insulin-stimulated skeletal muscle glucose uptake in the high-fat-fed rat. Am J Physiol Endocrinol Metab. 279, E1064-E1071 (2000).
- Halseth, A. E., Bracy, D. P., Wasserman, D. H. Limitations to muscle glucose uptake due to high fat feeding. Am. J. Physiol. 279, E1064-E1071 (2000).
- Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294, 15-26 (2008).
- Cho, H. Insulin resistance and a diabetes mellitus-like syndrome in mice lacking the protein kinase Akt2 (PKB beta). Science. 292, 1728-1731 (2001).
- Dubois, M. J. The SHP-1 protein tyrosine phosphatase negatively modulates glucose homeostasis. Nat Med. 12, 549-556 (2006).
- Pacini, G., Thomaseth, K., Ahren, B. Contribution to glucose tolerance of insulin-independent vs. insulin-dependent mechanisms in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 281, 693-703 (2001).
- Herbach, N. Dominant-negative effects of a novel mutated Ins2 allele causes early-onset diabetes and severe beta-cell loss in Munich Ins2C95S mutant mice. Diabetes. 56, 1268-1276 (2007).
- Maeda, N. Diet-induced insulin resistance in mice lacking adiponectin/ACRP30. Nat Med. 8, 731-737 (2002).
- Potenza, M. A., Marasciulo, F. L., Tarquinio, M., Quon, M. J., Montagnani, M. Treatment of spontaneously hypertensive rats with rosiglitazone and/or enalapril restores balance between vasodilator and vasoconstrictor actions of insulin with simultaneous improvement in hypertension and insulin resistance. Diabetes. 55, 3594-3603 (2006).
- Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55, 390-397 (2006).
- Wasserman, D. H., Ayala, J. E., McGuinness, O. P.
