Summary
このプロトコルは、骨格筋から単離したミトコンドリアの呼吸を研究するための手順を説明します。このメソッドは、Scorranoから翻案されました
Abstract
ミトコンドリア細胞の生と死を制御する細胞内小器官です。彼らは、主要な代謝反応に関与ATPの大部分を合成し、カスケード2,3をシグナリングの数を調整する。過去と現在の研究者は、肝臓、脳や心臓4,5としてラットやマウスの組織から単離ミトコンドリアいる。近年、多くの研究者は、骨格筋のミトコンドリア機能の研究に焦点を当てている。
ここで、我々は骨格筋6からミトコンドリアを単離するために正常に使用した方法を説明します。この場合の手続きは、すべてのバッファーと試薬が新鮮作られ、骨格筋の250から500まで約100mgを必要している必要があります。我々は、ラットとマウス腓腹筋と横隔膜から単離したミトコンドリアを研究し、ラットの眼の筋肉。ミトコンドリアタンパク質濃度はBradfordアッセイで測定されます。それは、ミトコンドリアのサンプルが準備中に氷冷状態に保つことと機能に関する研究が比較的短い時間（〜1時間）以内に測定することが重要です。ミトコンドリア呼吸は37クラーク型電極（Oxygraphシステム）° C 7でポーラログラフ分析を用いて測定されます。酸素電極のキャリブレーションは、このプロトコルの重要なステップであり、それを毎日実行する必要があります。単離ミトコンドリア（150μg）を実験的バッファー（EB）の0.5mlに追加されます。状態2呼吸は、グルタミン酸の添加（5mMの）とリンゴ酸（2.5 mM）で始まります。その後、アデノシン二リン酸（ADP）（150μM）は状態3を起動するために追加されます。オリゴマイシン（1μM）、ATPアーゼの酵素ブロッカーは、状態4を推定するために使用されます。最後に、カルボニルシアニドp型[トリフルオロメトキシが] -フェニル-ヒドラゾン（FCCP、0.2μM）は5 measurestateに追加、または呼吸6非結合される。呼吸調節率（RCR）、状態4から状態3の比率は、各実験後に計算されます。 RCR≥4は、実行可能なミトコンドリアの準備の証拠として考えられている。
要約すると、我々は、生化学的（例えば、酵素活性、免疫、プロテオミクス）と機能に関する研究（ミトコンドリア呼吸）で使用することができる骨格筋から実行可能なミトコンドリアの単離のための方法を提示する。
Protocol
1。バッファーの調製
- 遠心5804Rの電源を入れ、4℃に設定37℃にIsotemp 3006D水浴とセットの電源を入れ
- 筋肉の分離の前に以下のソリューションを準備します。
- PBS：蒸留水（5粒/リットル）にリン酸緩衝生理食塩水（PBS）タブレットを溶かす。よく混ぜる。
- PBSを加えた10mMのEDTA：100mlの溶液を調製するためには、PBSの98 mlに500 mMのEDTAの2 mlを加える。
- 8Xミトコンドリアバッファー：0.6 Mの最終濃度のスクロース10.28グラム、遊離脂肪酸の400mgのウシ血清アルブミン（BSA）0.8％、160 mMの最終濃度のためのHEPESの2.08グラム、pHの最終濃度蒸留水で50mlに7.4〜とQS。
- 絶縁バッファ1（IB1は）：10に、215 mMの最終濃度のD -マンニトールの0.392グラム、最終濃度10 mM、500 mMのEDTA 200μlを加え8Xミトコンドリアバッファの1.25ミリリットル、7.4のpHとQS蒸留水とを添加した。
- 絶縁バッファ2（IB2は）：10に、215 mMの最終濃度のD -マンニトールの0.392グラム、3 mMの最終濃度は500 mMのEGTAの60μlを加え8Xミトコンドリアバッファの1.25ミリリットル、7.4のpHとQS蒸留水とを添加した。
- 実験的なバッファー（EB）：の最終濃度2.5mMのKH 2 PO 4を25μl、215 mMの最終濃度のD -マンニトールの0.392グラム、5 mMの最終濃度を500 mMのMgCl 2の100μlを追加する6.25μM、20μMの最終濃度を100 mMのEGTAを2μl、ミトコンドリアの緩衝液、pH7.4にし、QS蒸留水で10mlまでの1.25ミリリットル。
2。筋肉のアイソレーション
- アイスバケットでは、3つの10 mlのビーカー、ポッター-エルベージェム組織グラインダーと氷の上の楽器/消耗品その他のすべての必要を置く。すべては、実験を通して氷冷滞在する必要があります。
- 行って温水槽でアイスバケットとEBのIB1とIB2を置きます。
- three 10ミリリットルのビーカーでは、以下のソリューションを追加する必要があります。
- ビーカー1：PBSを10ml
- ビーカー2：PBS / EDTAを10ml
- ビーカー3：IB1 3 mlの
- 人道的としてローカルの動物実験使用の委員会によって承認されたラットを殺す。
- 急速に、骨格筋の250から500ミリグラムを分離ビーカー1で洗い流した後、ビーカー2に転送します。
3。均質化/ミトコンドリア単離
- ビーカー3に筋肉を移し、細かくはさみで筋肉を飾らない。
- ポッター-エルベージェムホモジナイザーに解決策を転送する。電動乳棒（ドリルプレスの仕事をする）すべての回で氷の中にチューブを保持する10回を使って筋肉をホモジナイズする。
- 4℃で10分間、700 グラム ℃であらかじめ冷却した2 mlのマイクロチューブや遠沈管にホモジネート転送
- 新しい冷却した新しいマイクロチューブに上清を移す。ペレットを捨てる。
- 4℃で10分間、10500 グラムで上清を遠心℃に
- 新しい冷却した新しいマイクロチューブやラベルのSN1（清番号1）と筋肉の種類に上清を移す。
- IB2500μlにペレットを再懸濁する。
- 4℃で10分間、10500 グラムで遠心℃、
- 新しい冷却した新しいマイクロチューブやラベルのSN2（清番号2）と筋肉の種類に上清を移します。
- IB2の100μlの最終的なミトコンドリアペレットを中断します。
- 数秒間minifugeのリスピン最終ミトコンドリア懸濁液。ペレットがある場合は、新しい冷却した新しいマイクロチューブに上清を移すと、ペレットを捨てる。
- ブラッドフォードアッセイ8を使用してタンパク質濃度を決定する。
4。電極のキャリブレーション
注：ミトコンドリア分離時の完全な電極のキャリブレーション。
- 250mlのフラスコに100mlの蒸留水を追加。大気中のガスと水を平衡化し、20分間激しく攪拌。
- Oxygraph電極にKClを50％の数滴を追加します。
- 電極の上にブルーリズラ圧延紙の小片を置きます。
- ローリングペーパーの上にPTFEの膜の一部を置きます。
- リングのアプリケーターを用いて内輪を適用し、電極の溝に外輪を置きます。
- 電極を接続し、機器の残りのアセンブル：大きなプラスチック製のリングのベース、ミトコンドリア室、および水のホースを。
- Oxygraphボックスをオンにし、Oxygraphのソフトウェアを起動します。
- ミトコンドリア室に平衡水を追加。
- 攪拌棒を、60の速度にオン追加。
- 新しい実験を始める。
- キャリブレーションをクリックし、ボックス1の液相のキャリブレーション。温度を37に変更° Cと"OK"を2回クリックします。
- "OK"と"上書き"の変更は、それをクリックし、窒素ガスのタンクを開くと。
- 接続されている場所のヒントチャンバー内に窒素タンクへとゼロ酸素を確立する。それが切り替わる時、"OK"をクリックして"上書き。"
- 水を吸引し、ミトコンドリアのチャンバーへのEB緩衝液500μlを加える。
- プランジャーとシールチャンバー。
- ボックス2のキャリブレーションのため11月15日、複数のボックスは、手順を使用している場合。
5。ミトコンドリア呼吸
- 新しい実験を開始し、その信号を安定させるために約1分間実行してみましょう。
- 各チャンバーに150μgのためにミトコンドリア懸濁液（ステップ3.11）の必要量、マークイベントを追加し、それが1分間実行してみましょう。
- 5 mM/2.5 mMの最終濃度のウォーム250 mM/125 mMのグルタミン酸/リンゴ酸を10μlを添加します。マークし、1分間実行してみましょう。これは、状態2のように定義されます。
- -150μMの最終濃度10 mMのADP7.5μlの、マークを、追加し、30秒間実行してみましょう。これは状態3と定義されています。
- 10 mMのADP、マークの別の7.5μlのを追加し、1.5分間実行してみましょう。
- 1μM、マークの最終濃度のために冷10 mMのオリゴマイシンの0.5μlを加え、3分間実行してみましょう。これは、状態4のように定義されます。
- 0.2μM、マークの最終濃度のコールド0.1mMのFCCPの1μlを加え、3分間実行してみましょう。これは、状態5として定義されています。
- 終了したら、実験を終了して保存する。
- Oxygraphソフトウェアを使用して呼吸速度を取得する。
- 正規化係数を入力してください：ミトコンドリアタンパク質150μgを添加すると、正規化係数は0.15となります。
- さまざまな呼吸状態のために正規化された呼吸速度を計算する。
- 状態4によって状態3で割って呼吸調節率（RCR）を計算する。
6。代表的な結果：
図1は、。ミトコンドリア骨格筋での酸素消費量のトレース代表を示しています。電極信号が安定した後、ミトコンドリアサンプルはOxygraph室に追加されます。状態2呼吸は、グルタミン酸とリンゴ酸の添加により開始されます。 ADPの添加は、状態3呼吸を定義する、酸素消費量を増加させる。 ATP合成酵素は、状態4呼吸を得るためにオリゴマイシンを添加することによってブロックされます。最後に、FCCPはミトコンドリア呼吸（状態5）を切り離すために追加されます。 表1は、状態2、3、4、5の代表的酸素消費率を示しています。呼吸調節率（RCR）は、それぞれの実験のために計算されます。 RCR≥4は、実行可能なミトコンドリアの準備の証拠として考えられている。
国 | 正規化されたレート |
状態2 | 34.74 |
状態3 | 153.40 |
状態4 | 16.49 |
状態5 | 143.70 |
RCR | 9.30 |
表1。ミトコンドリア呼吸速度。ミトコンドリア骨格筋からRepresentativeoxygen消費率。値は、チャンバーに追加されたミトコンドリアの量に正規化されます。呼吸調節率（RCR）が状態4によって状態3で割ることによって決定されます。 RCR≥4は、実行可能なミトコンドリアの準備を表します。
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Discussion
我々は、骨格筋から実行可能なミトコンドリアを分離するためのプロトコルを提示する。歩留まりに問題がある場合、プロトコルは氷中で30分間PBS/10mM EDTA/0.01％のトリプシン5mlに分離された筋肉をインキュベートすることによって変更することができます。トリプシンとの完全な筋肉の消化を確保するために、筋肉は完全にみじん切りする必要があります。 30分間のインキュベーション後、PBS/10mM EDTA/0.01％のトリプシン溶液を完全にアイソレーションバッファ1（IB1）3mlで交換する必要があります。さらに、トリプシンの使用は、呼吸のプロトコル中にあるミトコンドリアの基質を妨げる可能性があります。トリプシンを用いて良好なミトコンドリア調製物中のこのプロトコルの結果で使用されているすべての基板。
マウス骨格筋の場合、それは両足から腓腹筋を組み合わせる、または全体のダイアフラムを使用するのが最適です。ラット骨格筋の場合は、腓腹筋や横隔膜の小さなセクションで十分です。過度の筋肉量は収率の低下に分離手順と結果を複雑にすることができます。このような外眼筋のような非常に小さな筋肉の分離には、それは必要な筋肉量を得るために1以上の動物からプールの筋肉に必要です。
SN1とSN2：このプロトコルは、2つの異なる上清を指します。これらの上清は、分画遠心法の結果であり、非ミトコンドリアタンパク質が含まれています。これらの上清からして、最終的なミトコンドリアペレットからのタンパク質は、ミトコンドリアの準備の純度を検証するためにウエスタンブロットで使用することができます。ミトコンドリアと細胞質抗体を用いたウェスタンブロットでは、最終的なペレットにしてミトコンドリアの準備の純度を確認する。
ミトコンドリア呼吸装置をクリーニングすると、成功した実験のための非常に重要です。各実験後、チャンバーは、次のように徹底的に洗浄しなければならない：最終的に、約5分間PBS / BSAの飽和溶液で洗浄、エタノール可溶性の基質を除去するために70％エタノールで1回すすぎ、蒸留水で5回のチャンバーをすすぎ、蒸留水でチャンバーを5回すすいでください。クラーク型の電極は適切に蒸留水で数回洗浄し、歯ブラシで優しくスクラブでは毎使用後に洗浄しなければならない。その後、彼らは完全に四旬節 - フリーワイプで乾燥し、デシケーター中で保存する必要があります。週に一度、電極がOxygraphの研磨キットを用いて研磨する必要があります。
ミトコンドリア基質は-20 o Cでで、ストック溶液として調製分注し、保存されています我々は、基板の再使用はお勧めしません。我々の経験では、基板のほとんどは、2ヶ月毎程度交換する必要があるオリゴマイシンを除いて、数ヶ月、-20 ° Cの時に安定しています。常により多くの詳細については、製造元の仕様を参照してください。
最後に、このプロトコルはまた、心臓からミトコンドリア単離するために使用することができます。他の筋肉と同様に、動物の大きさ（ラット対マウス）は十分なミトコンドリアを得るために必要な臓器の部分がどれだけあるかを判断します。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、国立眼研究所（R01 EY12998）からFH Andradeさんへの助成金によって支えられている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 95% CO2 / 5% O2 mix | Local Gas Supplier | ||
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Blue Rizla Paper | Hansatech | 890101 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | ||
| Compressed nitrogen | Local Gas Supplier | ||
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | M9647 | |
| Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio-Rad | 161-0728 | |
| Free fatty acid bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G5889 | |
| HEPES sodium salt | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Isotemp 3006D | Fisher Scientific | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Male Sprague Dawley Rats | Harlan Laboratories | 300-500g | |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M9138 | |
| Minifuge | ISC Bioexpress | C1301P | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Oxygen electrode disc | Hansatech | S1 | |
| Oxygraph | Hansatech | ||
| Oxygraph Plus V1.01 Software | Hansatech | ||
| pH-meter | Mettler Toledo | 1225506149 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | P8416 | |
| Potter-Elvehjem homogenizers | Fisher Scientific | 08-414-14A | |
| PTFE (0.0125mm × 25mm) membrane | Hansatech | S4 | |
| SKIL 3320 drill press | Hardware store | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 |
References
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