Ofrecemos un método para probar variantes de BRCA1 en un ensayo de cultivo de tejidos para la reparación basada en la recombinación homóloga de ADN dañado por el agotamiento de la proteína BRCA1 endógena a partir de una célula utilizando ARN de interferencia y su sustitución por un mutante BRCA1 punto que contiene un cambio de codificación.
El análisis funcional de las mutaciones sin sentido puede ser complicado por la presencia en la célula de la proteína endógena. Estructura-función de los análisis de los genes BRCA1 se han complicado por la falta de una prueba sólida de la proteína de longitud completa BRCA1 y las dificultades inherentes a la utilización de líneas celulares que expresan la proteína BRCA1 hypomorphic 1,2,3,4,5. Hemos desarrollado un sistema mediante el cual se agotó la proteína BRCA1 endógeno en una célula de forma aguda por RNAi dirigidas a la 3'-UTR del ARNm de BRCA1 y reemplazado por la co-transfección de un plásmido que expresa una variante BRCA1. Una de las ventajas de este procedimiento es que el silenciamiento aguda de la sustitución de los genes BRCA1 y simultánea permiten que las células crezcan sin mutaciones secundarias o adaptaciones que puedan surgir con el tiempo para compensar la pérdida de la función de BRCA1. Este agotamiento y el procedimiento add-back se llevó a cabo en una línea celular HeLa derivados que se ensayó con facilidad para la actividad de recombinación homóloga. El ensayo de recombinación homóloga se basa en un método previamente publicado por el cual se integra un sustrato de la recombinación en el genoma (Figura 1) 6,7,8,9. Este sustrato tiene la rara recombinación de corte I-II CPE sitio de la enzima de restricción dentro de un alelo inactivo GFP, y aguas abajo es un segundo alelo GFP inactivo. Transfección del plásmido que expresa la I-SCE ocasiona una ruptura de doble cadena, que pueden ser reparados por la recombinación homóloga, y si la recombinación homóloga no reparar la ruptura que crea un alelo GFP activo que es fácilmente marcado por citometría de flujo para la expresión de la proteína GFP . El agotamiento de los genes BRCA1 endógena produjo una reducción de 8 a 10 veces en la actividad de recombinación homóloga, y add-back de tipo salvaje función plásmido recombinación homóloga totalmente restaurada. Cuando los mutantes de puntos específicos de los genes BRCA1 longitud total se expresa a partir de co-transfectadas plásmidos, el efecto de los mutantes sin sentido específico se pudo calificar. A modo de ejemplo, la expresión de los genes BRCA1 (M18T) de proteína, una variante de significado desconocido clínica 10, se expresa en estas células, que no pudo restaurar BRCA1 dependientes de la recombinación homóloga. Por el contrario, la expresión de otra variante, también de significado desconocido, BRCA1 (I21V) totalmente restaurada BRCA1 dependiente de recombinación homóloga función. Esta estrategia de las pruebas de la función de los genes BRCA1 mutaciones sin sentido se ha aplicado a otro sistema biológico ensayo para la función del centrosoma (Kais y otros, observaciones no publicadas). En general, este enfoque es adecuado para el análisis de mutantes sin sentido en cualquier gen que se deben analizar recesiva.
La ventaja de este método es que se puede estudiar la función de la proteína BRCA1 en la regulación de la reparación del ADN por recombinación homóloga utilizando células que han de tipo salvaje BRCA1 endógena expresó. Hemos adoptado dos métodos para establecer de estudiar el proceso de recombinación homóloga y de la utilización de RNAi agotamiento para obtener el nuevo método para las pruebas de BRCA1 variantes de función en la reparación del ADN. La clave para el éxito de este método consistía en establecer una línea de células fácilmente transfectable, tales como HeLa, con el sustrato de la recombinación en el genoma de tal manera que se obtienen altos niveles de conversión de las buenas prácticas agrarias. Hemos tenido múltiples clones seleccionados de la transformación original con el fin de obtener una que no tenía ninguna señal de fondo GFP detectable, pero a la transfección de la expresión I-SCE plásmido tenía un nivel muy alto de conversión de las buenas prácticas agrarias.
Con este método, se están investigando otros residuos específicos BRCA1 aminoácidos para la función en la recombinación homóloga. Junto con los conocimientos biológicos de este trabajo, estas conclusiones se pueden aplicar a la genética del cáncer clínico. Un alto porcentaje de mutaciones missense BRCA1 tienen un significado clínico desconocido ya que hay muchas variantes raras y no hay información suficiente para muchos de estos para determinar la asociación del cáncer mediante análisis de la segregación genética 3,10,13,14. Usando este método, las consecuencias de una variante específica de la función biológica de los genes BRCA1 en la regulación de la recombinación homóloga podría ser utilizado para informar a las mujeres que llevan una de estas variantes en su genoma.
The authors have nothing to disclose.
Estamos agradecidos con el Centro de Cáncer de la Universidad Estatal de Ohio Integral para proporcionar fondos para este trabajo.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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DMEM | Invitrogen | 11960 | ||
FBS | USA Scientific | 9871-5200 | ||
siRNA | Invitrogen | N/A | ||
Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668 | ||
TrypLE | Invitrogen | 12604 | ||
Puromycin | Enzo Life Sciences | BML-GR312 | ||
Opti-MEM I | Invitrogen | 31985 | ||
Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360 | ||
GlutaMAX I | Invitrogen | 35050 | ||
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |