Summary
Nós fornecemos um método para testar variantes BRCA1 em um ensaio de cultura de tecidos com base homóloga de reparação de danos no DNA de recombinação, esgotando proteína BRCA1 endógenos de uma célula usando RNAi e substituindo-o por um mutante ponto BRCA1 que contém uma mudança de codificação.
Abstract
A análise funcional de mutações missense pode ser complicada pela presença na célula da proteína endógena. Estrutura-função análises do BRCA1 foram complicados pela falta de um ensaio robusta para a proteína BRCA1 todo o comprimento e as dificuldades inerentes ao trabalho com linhagens de células que expressam a proteína BRCA1 hypomorphic 1,2,3,4,5. Nós desenvolvemos um sistema em que a proteína BRCA1 endógena em uma célula tinha plena esgotados por RNAi visando o 3'-UTR do mRNA BRCA1 e substituído por co-transfecting um plasmídeo expressando uma variante BRCA1. Uma vantagem desse procedimento é que o silenciamento aguda de substituição BRCA1 e simultânea permitir que as células a crescer sem mutações secundárias ou adaptações que possam surgir ao longo do tempo para compensar a perda da função BRCA1. Este esgotamento e adicione-back procedimento foi realizado em uma linhagem de células HeLa-derivada que foi prontamente analisadas para a atividade de recombinação homóloga. O ensaio de recombinação homóloga é baseado em um método previamente publicado pelo qual um substrato de recombinação é integrado no genoma (Figura 1) 6,7,8,9. Este substrato recombinação tem a rara de corte I-SCEI site da enzima de restrição dentro de um alelo GFP inativos, ea jusante é um alelo GFP segundo inativos. Transfecção do plasmídeo que expressa I-SCEI resulta em uma quebra de cadeia dupla, que pode ser reparado por recombinação homóloga, e se a recombinação homóloga que reparar o quebrá-lo cria um alelo GFP ativo que é facilmente marcados por citometria de fluxo para expressão da proteína GFP . Esgotamento de BRCA1 endógena resultou em uma redução de 8-10 vezes na recombinação homóloga de atividade, e adicione-back de tipo selvagem função plasmídeo de recombinação homóloga totalmente restaurado. Quando os mutantes ponto específico de BRCA1 comprimento total foram expressos de co-transfectadas plasmídeos, o efeito do mutante missense específicos poderiam ser marcados. Como exemplo, a expressão da proteína BRCA1 (M18T), uma variante do significado clínico desconhecido 10, foi expresso nessas células, ele não conseguiu restaurar BRCA1-dependente de recombinação homóloga. Pela expressão de contraste, de outra variante, também de significado desconhecido, BRCA1 (I21V) totalmente restaurado BRCA1 dependentes de recombinação homóloga função. Esta estratégia de testar a função de mutações BRCA1 missense foi aplicado para outro sistema biológico assaying para a função centrossoma (Kais et al, observações não publicadas). No geral, esta abordagem é adequada para a análise de mutantes missense em qualquer gene que devem ser analisados recessiva.
Protocol
1. Linha de célula com um substrato Recombinação Integrado
- As células HeLa foram estavelmente transformada com PDR-GFP (dom 7 plasmídeo de M. Jasin, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center) e mantidos em puromicina para a seleção de transformantes.
- As células são passado em DMEM / SFB, contendo 10% de soro fetal bovino, 2 mM Glutamax, piruvato de sódio 1 mM, a penicilina / estreptomicina (100 U / mL/0.1 mg / mL), e 1,5 puromicina ug / mL.
O substrato de recombinação na pDR GFP-plasmídeo, e em transformantes estáveis, contém dois alelos inativos da GFP (Figura 1). Um alelo está inativo devido à inclusão em sua seqüência de codificação da restrição bp 18 sítio de reconhecimento da enzima para a I-SCEI. Expressão de I-SCEI nestas células cria uma quebra de DNA de fita dupla (DSB). Há um segundo alelo de GFP inativos nesta DNA, mas a parte de sua seqüência correlacionados com o site I-SCEI sobre o alelo primeira é do tipo selvagem. Este alelo GFP segundo pode funcionar como um doador de seqüência para homólogos de reparo de recombinação do DSB e resultaria em um alelo GFP ativo, que é facilmente detectada por citometria de fluxo. Alternativamente, o DSB pode ser reparado por nonhomologous final de adesão, que iria destruir o sítio de restrição I-SCEI e resultaria em células GFP-negativos. O nível de recombinação homóloga em uma célula é determinado pela contagem da porcentagem de células positivas para GFP-.
Esta linhagem celular, pHeLa-DR13-9, foi selecionado entre todos os clones para zero GFP sinal de fundo e uma percentagem relativamente elevada de células positivas para GFP-transfecção em cima com o I-SCEI expressar pCBASce, plasmídeo. (O pCBASce e seu controle de vetores, pCAGGS, foram ambos fornecidos pela M. Jasin do Centro de Câncer Memorial Sloan-Kettering.)
A linha HeLa-DR13-9 celular está disponível a partir dos autores, mediante solicitação.
2. Transfecção de Destroem BRCA1 endógena e Add Voltar BRCA1 mutante.
- O dia antes da transfecção primeiro (geralmente uma terça-feira): Comece com um prato de 10 cm de HeLa-DR13-9 células, pelo menos, 90% confluentes.
- Trypsinize em 1 mL e parar a reacção adicionando 9 mL DMEM / SFB, misture bem por pipetagem.
- Adicionar 40 mL de células tripsinizados por poço de uma placa de 24 poços em 0,5 mL de DME / FBS.
- Dia 1 transfections (quarta-feira): as células devem ser confluentes ~ 40-50%, se muito menos começar de novo. Transfecção através da mistura de: 5 siRNA pmol + 0,3 ug-BRCA1 mutante expressar DNA plasmídeo em 12,5 mL Opti-MEM; e 0,5 mL Lipofectamine 2000 em 12,5 mL Opti-MEM. Prosseguir com a transfecção de acordo com o protocolo Lipofectamine (Invitrogen).
- Substituir a mídia de 4-6 horas mais tarde. O siRNA que usamos para esgotar BRCA1 é baseada na seqüência GCUCCUCUCACUCUUCAGU especificando BRCA1 3'-UTR seqüências de 80.780 para 80.798 (número de adesão AY273801).
- Dia 2: Transferência de células por trypsinizing da placa de 24 poços a uma placa de 6 bem.
- Dia 3 transfections: 25 siRNA pmol + 0,75 ug-BRCA1 mutante expressar DNA plasmídeo + 0,75 ug pCBASce (ou pCAGGS controle de vetores) em 62,5 mL Opti-MEM e 2,5 mL Lipofectamine 2000 em 62,5 mL Opti-MEM. Substituir a mídia de 4-6 horas mais tarde.
3. Análise de Transfectants.
- No dia 6, trypsinize células de cada poço e parar em 1 mL DMEM / SFB. Analisando as células de expressão GFP pode ser feito nos dias 5 ou 7, mas nós achamos que o dia 6 funciona melhor.
- Analisar 10.000 células por poço por citometria de fluxo. Nós usamos um instrumento Becton Dickinson FACSCalibur na Universidade Estadual de Ohio Comprehensive Cancer Center Citometria Analytical recurso compartilhado. Único, as células vivas são fechados utilizando os parâmetros de dispersão para a frente e lateral. GFP células positivas são detectadas usando o GFP detector de fluorescência (FL1), e os resultados são apresentados como um histograma (Figura 2, abaixo).
- Esquerda sobre as células podem ser replated para a fotografia de microscopia de fluorescência, se desejar.
4. Resultados representativos:
BRCA1 regula o caminho para a reparação de DNA de fita dupla breaks por recombinação homóloga 6,11. As células que sofreram reparo por recombinação homóloga são facilmente detectados por microscopia de fluorescência (Figura 2, em cima). Esgotamento dos resultados BRCA1 em uma diminuição da GFP-positivos detectados células (Figura 2, à direita). A saída do FACSCalibur é um histograma com intensidade GFP por célula no eixo X e do número de células no eixo Y (Figura 2, abaixo). Em um conjunto típico de resultados a partir de um único experimento, 15,5% das células foram GFP-positivo após I-SCEI expressão e de esgotamento controle RNAi (Figura 3). Em comparação, o esgotamento dos genes BRCA1 e vector adicionar novamente reduzida GFP-conversão para 0,7%. Add-back de tipo selvagem BRCA1 ou de BRCA1 (I21V) totalmente restaurado recombinação homóloga, detectada através da obtenção de 15-16% de células positivas para GFP. Add-back do BRCA1 (M18T) mutantes (Figura 3, faixa 5) teve efeito semelhante ao add-parte de trás do controle de vetores. Uma vez que esta variante expressa em níveis semelhantes como a proteína endógena 9, que assim interpretar o BRCA1 variante (M18T) não é funcional na recombinação homóloga.
Nós normalmente têm 10-20% das células se converter ao GFP-positivo após transfecting a expressão I-SCEI plasmídeo. Esgotamento de BRCA1 reproducibly reduz a conversão de células positivas para GFP-por cerca de 8-10 vezes. Embora as porcentagens reais de GFP células positivas podem mudar de experimento para experimento, a proporção de células positivas para GFP-seguintes esgotamento BRCA1 em relação ao esgotamento de controle dentro de um experimento é bastante consistente. Nós normalizar os resultados, definindo a taxa de conversão desinibida a 100% e os resultados expressam com esgotamento BRCA1 e adicione-backs como porcentagens. Desta forma, podemos combinar múltiplas experiências, ea variação experimental não é alto.
Adicionar volta de mutantes BRCA1, até agora, produziu resultados robustos: cada variante BRCA1 tem ou totalmente restaurado homóloga atividade recombinação ou não teve efeito. Uma consideração importante na obtenção destes resultados é que as nossas condições de transfecção produzir níveis de proteína BRCA1 que aproximadamente igual a concentração da proteína endógena nas células não tratadas. Muito alto de uma superexpressão de mutante mesmo um defeito de BRCA1 pode resultar em alguma atividade de recombinação homóloga positiva.
Um problema que nós precisávamos de superar foi a toxicidade de transfecção. Esgotamento do BRCA1 em si pode retardar o crescimento de células, e do balanço de DNA Lipofectamine-2000 e plasmídeo em relação ao número de células no prato deve ser realizada em um nível consistente. DNA muito Lipofectamine ou plasmídeo irá reduzir o número de células eo número de células será insuficiente para obter resultados confiáveis citometria de fluxo. O saldo dos reagentes plasmídeo e Lipofectamine versus o número de células transfectadas é muito importante para a manutenção da viabilidade das células.
Figura 1. O substrato recombinação. A estratégia que tinha sido desenvolvido pelo grupo de M. Jasin 7,12 é retratado. O pDR GFP-plasmídeo contém dois alelos defeituosos da GFP, um dos quais contém um I-SCEI site de endonuclease de restrição. A linhagem de células HeLa derivados contém este substrato DNA integrados em um único site no genoma 9, e reparação ativa da quebra de DNA double-stranded no site I-SCEI por recombinação homóloga resultados na conversão de um alelo para GFP-positivo.
Figura 2. Detecção de GFP células positivas por microscopia de fluorescência. As células foram testados de acordo com este protocolo e controle de depleção de células estavam ativas na recombinação homóloga, detectada por uma alta porcentagem de células com expressão GFP (esquerda). Esgotamento de BRCA1 por resultados RNAi em uma diminuição acentuada no número de células positivas para GFP-(direita).
Figura 3. Resultados de um add-back de mutantes missense BRCA1. Os resultados de um único experimento são mostrados neste histograma. Na ausência de transfectadas I-SCEI expressar plasmídeo (pista 1) não há células GFP-positivos detectados. Os resultados em pistas 06/02 foram todas tomadas a partir de células em que o I-SCEI expressar plasmídeo foi transfectado no dia 3. Em células que foram perdidos por um gene irrelevante (luciferase) e com o vector add-back, 15,5% das células foram GFP-positivo (pista 2). Esgotamento dos genes BRCA1 e vector add-volta revela o efeito da perda de BRCA1 na recombinação homóloga (faixa 3). Os efeitos da depleção de BRCA1 e adicione-back de tipo selvagem BRCA1 (faixa 4), BRCA1 (M18T) (faixa 5), e BRCA1 (I21V) (faixa 6) são mostrados. Estes resultados são de um único experimento, e seria combinada com pelo menos dois experimentos mais repetir a fim de obter uma medida da recombinação homóloga apoiado por uma proteína BRCA1 dado mutante.
Discussion
A vantagem deste método é que podemos estudar a função da proteína BRCA1 na regulação do reparo do DNA por recombinação homóloga, utilizando células que tipo selvagem BRCA1 endogenamente expressa. Adotamos dois distintos métodos estabelecidos de estudar o processo de recombinação homóloga e da utilização de RNAi mediada por esgotamento para obter o novo método para testar variantes BRCA1 para a função no reparo do DNA. A chave para o sucesso deste método foi o de estabelecer uma linha celular prontamente transfectable, tais como HeLa, com o substrato de recombinação no genoma de tal forma que obtemos níveis muito elevados de conversão GFP. Tivemos vários clones selecionados da transformação original, a fim de obter um que não tinha nenhum sinal de GFP detectáveis de fundo, mas em cima de transfecção da expressão I-SCEI plasmídeo teve um nível muito alto de conversão de GFP.
Com este método, nós agora estamos investigando outros específicos BRCA1 resíduos de aminoácidos para a função na recombinação homóloga. Juntamente com os insights biológicos a partir deste trabalho, estas conclusões podem ser aplicadas a genética do câncer clínico. A elevada percentagem de mutações BRCA1 missense têm significado clínico desconhecido desde há muitas variantes raras e não há informação suficiente para muitas destas para determinar a associação do câncer através da análise de segregação genética 3,10,13,14. Usando este método, as consequências de uma variante específica sobre a função biológica do BRCA1 na regulação da recombinação homóloga poderia ser usado para informar as mulheres que carregam uma dessas variantes em seu genoma.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Somos gratos à Universidade Estadual de Ohio Comprehensive Cancer Center para a concessão de financiamento para este trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11960 | |
| FBS | USA Scientific, Inc. | 9871-5200 | |
| siRNA | Invitrogen | N/A | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668 | |
| TrypLE | Invitrogen | 12604 | |
| Puromycin | Enzo Life Sciences | BML-GR312 | |
| Opti-MEM I | Invitrogen | 31985 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360 | |
| GlutaMAX I | Invitrogen | 35050 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |
References
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