Summary
我们提供了一个用于测试在一个组织文化同源重组修复DNA损伤的检测消耗使用RNA干扰细胞内源性BRCA1蛋白和替换它与BRCA1基因点突变，其中包含一个编码变化的BRCA1基因变体的方法。
Abstract
错义突变功能分析，可以是复杂的的内源性蛋白在细胞的存在。 BRCA1基因的结构与功能分析复杂，缺乏一个强大的检测全长BRCA1蛋白和细胞株，表达hypomorphic BRCA1基因蛋白1,2,3,4,5所固有的困难。我们开发出一种系统，即BRCA1蛋白在细胞内源性急性耗尽通过RNAi的目标的BRCA1基因3' - UTR和共同转染质粒表达的BRCA1变异所取代。此过程的一个优点是，BRCA1和同时更换急性沉默，使细胞成长过程中没有二次突变或改编，以弥补损失的BRCA1基因的功能随着时间的推移可能出现。这种枯竭和反加的程序是在HeLa细胞衍生的细胞株同源重组活动，随时检测。同源重组的分析是基于以前发布的方法，即重组基板整合到基因组（图1） 6,7,8,9。此重组基板内处于非活动状态的绿色荧光蛋白基因的罕见切割我SCEI限制酶切位点，下游是第二个处于非活动状态的绿色荧光蛋白基因。表示在一个双链的断裂，这可能是通过同源重组修复我SCEI结果，如果同源重组修复突破，它创建了一个活跃的绿色荧光蛋白基因GFP蛋白表达的流式细胞仪检测，很容易取得的质粒转染。在8〜10倍，在同源重组活动的减少，导致内源性BRCA1基因的消耗和添加回野生型质粒同源重组完全恢复功能。当特定的点突变全长BRCA1基因共转染质粒表示，具体的错义突变的影响可以得分。作为一个例子，在这些细胞中的BRCA1蛋白（M18T），不明的临床意义10的一个变种，表达的表达，它未能恢复依赖BRCA1基因同源重组。通过对比，表达另一种变体，也未知意义，I21V），BRCA1基因（BRCA1基因相关的同源重组功能完全恢复。这种检测BRCA1基因的错义突变功能的策略已被应用到另一种生物系统的化验中心体的功能（凯斯卡布等，未发表意见）。总体而言，这种方法适合在任何必须分析隐性基因的错义突变分析。
Protocol
1。综合复合基板的细胞系
- PDR - GFP（质粒7 M. Jasin，纪念斯隆-凯特琳癌症中心的礼物）的HeLa细胞稳定转化，在转化的选择嘌呤维持。
- 细胞传代的DMEM / FB的，含10％小牛血清，GlutaMAX 2毫米，1毫米丙酮酸钠，青霉素/链霉素（100 U / mL/0.1毫克/毫升），和1.5微克/毫升的嘌呤。
在PDR - GFP质粒，并在稳定转化的重组基板，包含两个等位基因GFP（图1）处于非活动状态。一个等位基因是无效的，由于其编码序列的18 bp的限制性内切酶识别位点我SCEI列入。在这些细胞中的表达我的SCEI创建一个双链DNA断裂（DSB）。有这种DNA无效的GFP的第二个等位基因，但我SCEI网站上的第一个等位基因相关的部分，其序列与野生型。这第二次绿色荧光蛋白基因可作为一个序列同源重组修复的DSB捐助，将在一个活跃的绿色荧光蛋白基因，这是很容易，流式细胞仪检测结果。另外，DSB通过非同源末端连接，这将破坏我SCEI限制网站，并会导致GFP阴性细胞可以修复。在细胞同源重组的高低是由计数GFP阳性细胞的百分比。
pHeLa - DR13 - 9，该细胞系，被选为各克隆零背景GFP信号和GFP阳性细胞表达质粒，pCBASce后转与I - SCEI的比例相对较高。 （pCBASce和它的矢量控制，pCAGGS，同时提供由M. Jasin的纪念斯隆 - 凯特琳癌症中心。）
应要求作者提供的HeLa - DR13 - 9细胞株。
2。转染消耗内源性BRCA1基因突变的BRCA1加回。
- 第一染（通常是一个星期二）前一天：开始的HeLa - DR13 - 9细胞至少有90％的融合与一个10厘米的菜。
- Trypsinize 1 mL和停止反应，加入9毫升的DMEM / FB的吹打混合以及。
- 添加40μL胰酶消化细胞，每孔0.5毫升/ FB的二甲醚在24孔板。
- 第1天转染（星期三）：细胞应约40-50％的汇合，如果要少得多重新来过。混合转染：5 pmol的siRNA + 0.3微克BRCA1基因突变表达质粒12.5μLOPTI - MEM DNA和0.5μL脂质体2000年以12.5μLOPTI - MEM。根据脂质体协议（Invitrogen公司）进行转染。
- 媒体4-6小时后更换。我们使用消耗BRCA1基因的siRNA是基于指定BRCA1基因3' - UTR序列的80780到80798（登录号AY273801）序列GCUCCUCUCACUCUUCAGU。
- 第2天：从24孔板trypsinizing到6孔板细胞转移。
- 第3天转染：25 pmol的siRNA + 0.75微克BRCA1基因突变表达质粒DNA + 0.75微克pCBASce 62.5μLOPTI - MEM和2.5μL脂质体2000年62.5μLOPTI - MEM（或pCAGGS矢量控制）。媒体4-6小时后更换。
3。分析转染。
- 第6天，trypsinize每口井的细胞，并停止在1毫升的DMEM / FB的。分析GFP表达的细胞可以在5或7天，但我们发现，每天6效果最好。
- 流式细胞仪分析10000个细胞。我们使用一个碧迪FACSCalibur仪器，在美国俄亥俄州立大学综合癌症中心的分析流式细胞仪共享资源。单，活细胞的门使用的前部和侧散射参数。使用GFP荧光检测器（FL1）检测到GFP阳性细胞，结果作为一个直方图（图2，底部）。
- replated留在以上细胞可以通过荧光显微镜摄影，如果需要的话。
4。代表性的成果：
BRCA1基因调节的途径，通过同源重组 6,11双双链DNA断裂修复。那些已经发生同源重组修复细胞很容易检测到荧光显微镜（图2，顶部）。减少在检测到GFP阳性细胞（图2右）在BRCA1基因的结果枯竭。从FACSCalibur的输出是在X轴和Y轴（图2，底部）的细胞数，每单元的强度与GFP的直方图。在一个典型的设置从单一的实验结果，15.5％的细胞GFP阳性后，我SCEI表达和控制RNAi的枯竭（图3）。相比之下，BRCA1和矢量枯竭加回减少GFP转换至0.7％。反加野生型BRCA1或完全恢复的BRCA1基因（I21V）同源重组，获得15-16％GFP阳性细胞的检测。反加的BRCA1供应量（M18T）突变体（图3，泳道5）矢量控制添加回类似的效果。由于这种变异9作为内源性蛋白表达水平相似，因此，我们解释的BRCA1（M18T）变种非同源重组功能。
我们通常有10-20％的细胞转换我SCEI表达质粒转染后GFP阳性。重复性的BRCA1基因的消耗减少约8-10倍的GFP阳性细胞的转化。虽然GFP阳性细胞的实际比例可能会改变在一项实验中，相对于控制枯竭的BRCA1基因枯竭实验，实验中，GFP阳性细胞的比例是相当一致的。我们通过设置不羁的转换率100％，与BRCA1基因枯竭和百分比的附加回的表达结果正常化的结果。这样，我们可以结合多个实验，实验的变化是不高的。
添加BRCA1基因的突变体，迄今已取得了强劲的结果：每个BRCA1基因变种完全恢复同源重组活动，或有没有效果。在取得这些成果的一个重要的考虑是，我们的转染条件BRCA1蛋白的生产水平，约等于在未经处理的细胞内源性蛋白的浓度。太多的甚至是BRCA1基因的突变体的过度表达可能导致了一些积极的同源重组活动。
我们需要克服的一个问题是转染的毒性。 BRCA1基因本身的消耗，可以减缓细胞的生长，脂质体2000年和质粒DNA盘上的细胞数量相对的平衡，必须在一致的水平。过多的脂质体或质粒DNA会减少细胞的数量，以及细胞的数量将不足以获得可靠的流式细胞仪检测结果。与转染细胞的数量的质粒和脂质体转染试剂的平衡是很重要的，对维持细胞的可行性。
图1。重组基板。 M. Jasin 7,12组已制定的策略是描绘。 PDR - GFP质粒包含两个绿色荧光蛋白基因有缺陷的等位基因，其中包含一个I - SCEI限制性内切酶位点。一个HeLa细胞源性细胞株包含此集成在基因组中的9的单个站点中的DNA底物，并积极修复的同源重组中的一个等位基因的转换GFP阳性的结果在我的SCEI网站的双链DNA打破。
图2荧光显微镜检测GFP阳性细胞。细胞按照此协议，测试和控制亏损的细胞活跃在同源重组中，由高比例的细胞与绿色荧光蛋白表达（左）检测。耗尽的BRCA1基因的GFP阳性细胞（右）的数量在急剧下降的RNAi结果。
图3。BRCA1基因的错义突变体的添加回结果。从单一的实验结果显示在此柱状图。在没有表达质粒转我的SCEI（巷1）有没有检测GFP阳性细胞。泳道2-6的结果都是从我SCEI表达质粒转染第3天的细胞。在细胞被耗尽无关（荧光素酶）基因和载体添加回，15.5％的细胞GFP阳性（2巷）。 BRCA1和矢量的消耗反加揭示损失的BRCA1基因同源重组的效果（泳道3）。 BRCA1和枯竭（4车道）的野生型BRCA1基因，BRCA1基因（M18T）（5巷）和BRCA1（I21V）（6车道）加回的影响。这些结果是从单一的实验中，将与至少两个以上的重复实验，以获得支持一个给定的突变BRCA1蛋白的同源重组的措施相结合。
Discussion
这种方法的优点是，我们可以通过同源重组使用野生型的内源性表达BRCA1基因的细胞，具有调节DNA修复的BRCA1蛋白的功能研究。我们已经采取了两个独立的研究同源重组过程中，利用RNAi介导的枯竭，获得的新方法检测DNA修复功能的BRCA1基因变体的方法。这种方法成功的关键是建立一个现成的转染的细胞株，如HeLa细胞，在基因组中，我们获得非常高的水平GFP的转换与重组基板。我们已经筛选多个克隆原来的转型，以便获得一个没有检测到的背景GFP信号，但我SCEI表达质粒转染后GFP的转换的一个非常高的水平。
使用这种方法，我们正在调查其他具体BRCA1基因同源重组功能的氨基酸残基。随着这项工作的生物见解，这些结论可以应用于临床癌症遗传学。一个高比例的BRCA1基因的错义突变的临床意义不明，因为有许多罕见的变异，其中许多是有足够的信息来确定遗传分离分析3,10,13,14癌症协会。使用这种方法，可以用来上的BRCA1基因的生物学功能调节同源重组的具体变体的后果告知妇女携带自己的基因组，这些变种之一。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们非常感谢美国俄亥俄州立大学综合癌症中心为这项工作提供资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11960 | |
| FBS | USA Scientific, Inc. | 9871-5200 | |
| siRNA | Invitrogen | N/A | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668 | |
| TrypLE | Invitrogen | 12604 | |
| Puromycin | Enzo Life Sciences | BML-GR312 | |
| Opti-MEM I | Invitrogen | 31985 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360 | |
| GlutaMAX I | Invitrogen | 35050 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |
References
- Carvalho, M. A. Determination of cancer risk associated with germ line BRCA1 missense variants by functional analysis. Cancer Res. 67, 1494-1501 (2007).
- Couch, F. J. Genetic epidemiology of BRCA1. Cancer Biol Ther. 3, 509-514 (2004).
- Couch, F. J. Assessment of functional effects of unclassified genetic variants. Hum Mutat. 29, 1314-1326 (2008).
- Tomlinson, G. E. Characterization of a breast cancer cell line derived from a germ-line BRCA1 mutation carrier. Cancer Res. 58, 3237-3242 (1998).
- Ruffner, H., Joazeiro, C. A., Hemmati, D., Hunter, T., Verma, I. M. Cancer-predisposing mutations within the RING domain of BRCA1: loss of ubiquitin protein ligase activity and protection from radiation hypersensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 5134-5139 (2001).
- Moynahan, M. E., Chiu, J. W., Koller, B. H., Jasin, M. Brca1 controls homology-directed DNA repair. Mol Cell. 4, 511-518 (1999).
- Nakanishi, K. Human Fanconi anemia monoubiquitination pathway promotes homologous DNA repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1110-1115 (2005).
- Pierce, A. J. Double-strand breaks and tumorigenesis. Trends Cell Biol. 11, 52-59 (2001).
- Ransburgh, D. J., Chiba, N., Ishioka, C., Toland, A. E., Parvin, J. D. Identification of breast tumor mutations in BRCA1 that abolish its function in homologous DNA recombination. Cancer Res. 70, 988-995 (2010).
- Easton, D. F. A systematic genetic assessment of 1,433 sequence variants of unknown clinical significance in the BRCA1 and BRCA2 breast cancer-predisposition genes. Am J Hum Genet. 81, 873-883 (2007).
- Snouwaert, J. N. BRCA1 deficient embryonic stem cells display a decreased homologous recombination frequency and an increased frequency of non-homologous recombination that is corrected by expression of a brca1 transgene. Oncogene. 18, 7900-7907 (1999).
- Pierce, A. J., Hu, P., Han, M., Ellis, N., Jasin, M. Ku DNA end-binding protein modulates homologous repair of double-strand breaks in mammalian cells. Genes Dev. 15, 3237-3242 (2001).
- Spearman, A. D. Clinically applicable models to characterize BRCA1 and BRCA2 variants of uncertain significance. J Clin Oncol. 26, 5393-5400 (2008).
- Sweet, K., Senter, L., Pilarski, R., Wei, L., Toland, A. E. Characterization of BRCA1 ring finger variants of uncertain significance. Breast Cancer Res Treat. 119, 737-743 (2009).
