Summary
Wij bieden een methode voor het testen van BRCA1 varianten in een weefselkweek gebaseerde test voor homologe recombinatie reparatie van DNA-schade door afbrekende endogene BRCA1-eiwit uit een cel met behulp van RNAi en te vervangen door een BRCA1-punt mutant die een codering wijzigen.
Abstract
De functionele analyse van missense mutaties kan worden bemoeilijkt door de aanwezigheid in de cel van de endogene eiwit. Structuur-functie analyse van de BRCA1 werden bemoeilijkt door het ontbreken van een robuuste test voor de volledige lengte BRCA1-eiwit en de moeilijkheden die inherent zijn aan het werken met cellijnen die hypomorphic BRCA1-eiwit 1,2,3,4,5 uit te drukken. We ontwikkelden een systeem waarbij de endogene BRCA1-eiwit in een cel acuut was uitgeput door RNAi gericht op de 3'-UTR van het BRCA1 mRNA en vervangen door co-transfectie een plasmide dat een BRCA1 variant. Een voordeel van deze procedure is dat de acute zwijgen van BRCA1 en gelijktijdige vervanging laat de cellen om te groeien zonder secundaire mutaties of aanpassingen die kunnen ontstaan na verloop van tijd te compenseren voor het verlies van BRCA1-functie. Deze uitputting en voeg-back procedure werd gedaan in een HeLa-afgeleide cellijn die gemakkelijk werd getest op homologe recombinatie activiteit. De homologe recombinatie test is gebaseerd op een eerder gepubliceerde methode waarbij een recombinatie substraat is geïntegreerd in het genoom (Figuur 1) 6,7,8,9. Deze recombinatie substraat heeft de zeldzame-cutting I-SCEI restrictie-enzym plaats in een inactieve GFP-allel, en stroomafwaarts is een seconde inactief GFP-allel. Transfectie van het plasmide, dat I-SCEI resultaten uit in een double-stranded breken, die kan worden gerepareerd door homologe recombinatie, en als homologe recombinatie niet repareren de pauze het creëert een actieve GFP allel dat gemakkelijk wordt gescoord door flowcytometrie voor GFP eiwitexpressie . Uitputting van endogene BRCA1 resulteerde in een 8-10-voudige afname in homologe recombinatie activiteit en add-achterkant van de wild-type plasmide volledig homologe recombinatie gerestaureerd functie. Wanneer specifieke punt mutanten van volledige lengte BRCA1 werden uitgedrukt van co-getransfecteerd plasmiden, kan het effect van de specifieke missense mutant worden gescoord. Als voorbeeld, de expressie van het BRCA1 (M18T) eiwit, een variant van onbekende klinische betekenis 10, werd uitgedrukt in deze cellen, is het niet BRCA1-afhankelijke homologe recombinatie te herstellen. Daarentegen, de expressie van een andere variant, ook van onbekende betekenis, BRCA1 (I21V) volledig gerestaureerd BRCA1-afhankelijke homologe recombinatie functie. Deze strategie van het testen van de functie van BRCA1 missense mutaties is toegepast op een ander biologisch systeem te testen op centrosoom functie (Kais et al., ongepubliceerde waarnemingen). Het geheel genomen is deze aanpak is geschikt voor de analyse van missense mutanten in een gen dat recessief moet worden geanalyseerd.
Protocol
1. Cellijn met een geïntegreerde Recombinatie Substrate
- De HeLa cellen werden stabiel getransformeerd met PDR-GFP (plasmide 7 geschenk van M. Jasin, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center) en het onderhoud van puromycine voor de selectie van transformanten.
- De cellen zijn gepasseerd in DMEM / FBS, dat 10% foetaal runderserum, 2 mM Glutamax, 1 mM natrium pyruvaat, penicilline / streptomycine (100 U / mL/0.1 mg / ml) en 1,5 ug / ml puromycine.
De recombinatie substraat in de PDR-GFP plasmide, en in stabiele transformanten, bevat twee niet-actieve allelen van GFP (Figuur 1). Een allel is niet actief te wijten aan de opname in de coderende sequentie van het 18 bp restrictie-enzym herkenningsplaats voor I-SCEI. Expressie van I-SCEI in deze cellen zorgt voor een double-stranded DNA break (DSB). Er is een tweede allel van inactieve GFP op dit DNA, maar het gedeelte van de sequentie ervan gecorreleerd met de I-SCEI site op de eerste allel is wild-type. Deze tweede GFP allel kan functioneren als een opeenvolging donor voor homologe recombinatie reparatie van de DSB en zou resulteren in een actieve GFP allel, dat gemakkelijk wordt gedetecteerd door flowcytometrie. Als alternatief zou de DSB worden gerepareerd door niet-homologe end-joining, die de I-SCEI restrictieplaats zou vernietigen en zou resulteren in GFP-negatieve cellen. Het niveau van homologe recombinatie in een cel wordt bepaald door het tellen van het percentage GFP-positieve cellen.
Deze cellijn, pHeLa-DR13-9, werd geselecteerd uit alle klonen voor nul achtergrond GFP signaal en een relatief hoog percentage GFP-positieve cellen na transfectie met de I-SCEI uiten plasmide, pCBASce. (De pCBASce en de vector-controle, pCAGGS, werden beide geleverd door M. Jasin van Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.)
De HeLa-DR13-9 cellijn is verkrijgbaar bij de auteurs op aanvraag.
2. Transfectie om Endogene BRCA1 afbreken, en Add Terug Mutant BRCA1.
- De dag voor de eerste transfectie (meestal een dinsdag): Begin met een 10 cm schotel van HeLa-DR13-9 cellen ten minste 90% confluent.
- Trypsinize in 1 ml en stop de reactie door het toevoegen van 9 ml DMEM / FBS, meng goed door pipetteren.
- Voeg 40 ul van getrypsiniseerd cellen per putje van een 24 wells plaat in 0,5 ml van de DME / FBS.
- Dag 1 transfecties (woensdag): cellen moeten ~ 40-50% confluent zijn, als veel minder beginnen. Transfecteren door het mengen van: 5 pmol siRNA + 0,3 ug BRCA1-mutant tot expressie plasmide DNA in 12,5 ul Opti-MEM en 0,5 pi Lipofectamine 2000 in 12,5 ul Opti-MEM. Ga verder met de transfectie volgens het Lipofectamine protocol (Invitrogen).
- Later vervangen door de media 4-6 uur. Het siRNA we gebruiken om BRCA1 afbreken wordt gebaseerd op de sequentie GCUCCUCUCACUCUUCAGU met vermelding van BRCA1 3'-UTR sequenties 80.780 naar 80.798 (toetreding nummer AY273801).
- Dag 2: Transfer van de cellen door trypsinizing van de 24 wells plaat met een 6 wells plaat.
- Dag 3 transfecties: 25 pmol siRNA + 0,75 ug BRCA1-mutant tot expressie plasmide DNA + 0,75 ug pCBASce (of pCAGGS vector controle) in 62,5 pi Opti-MEM en 2,5 pi Lipofectamine 2000 in 62,5 ul Opti-MEM. Later vervangen door de media 4-6 uur.
3. Analyse van de transfectanten.
- Op dag 6, trypsinize cellen uit elk putje en stoppen in 1 ml DMEM / FBS. Het analyseren van de cellen voor GFP expressie kan worden gedaan op dag 5 of 7, maar wij vinden dat de dag 6 het beste werkt.
- Analyseren van 10.000 cellen per well door flowcytometrie. We maken gebruik van een Becton Dickinson FACSCalibur instrument in de Ohio State University Comprehensive Cancer Center Analytische Cytometry gedeelde bron. Single, levende cellen worden gated gebruik van de forward en side scatter parameters. GFP-positieve cellen worden gedetecteerd met behulp van de GFP fluorescentie detector (FL1), en de resultaten worden gepresenteerd als een histogram (figuur 2, onderaan).
- Overgebleven cellen kunnen worden opnieuw uitgeplaat voor fotografie door middel van fluorescentie microscopie indien gewenst.
4. Representatieve resultaten:
BRCA1 regelt de weg voor reparatie van dubbelstrengs DNA breuken door homologe recombinatie 6,11. Die cellen die reparatie hebben ondergaan door homologe recombinatie gemakkelijk gedetecteerd door fluorescentie microscopie (figuur 2, bovenaan). Uitputting van BRCA1 resulteert in een afname van de gedetecteerde GFP-positieve cellen (figuur 2, rechts). De output van de FACSCalibur is een histogram met GFP intensiteit per cel op de X-as en het aantal cellen op de Y-as (figuur 2, onderaan). In een typische set resultaten uit een experiment, 15,5% van de cellen werden GFP-positieve nadat I-SCEI expressie en controle RNAi uitputting (figuur 3). Ter vergelijking, voeg uitputting van BRCA1 en vector weer gereduceerd GFP-conversie naar 0,7%. Add-back van de wild-type BRCA1 of van BRCA1 (I21V) volledig gerestaureerd homologe recombinatie, zoals gedetecteerd door het verkrijgen van 15-16% GFP-positieve cellen. Add-back van de BRCA1 (M18T) mutant (figuur 3, baan 5) had dezelfde strekking als de add-back van de vector te controleren. Omdat deze variant uitgesproken op een vergelijkbaar niveau als het endogene eiwit 9, we dus interpreteren de BRCA1 (M18T) variant is niet-functioneel in homologe recombinatie.
We hebben meestal 10-20% van de cellen om te zetten in GFP-positief na transfectie van de I-SCEI expressieplasmide. Uitputting van BRCA1 vermindert reproduceerbaar de conversie van GFP-positieve cellen met ongeveer 8-10 maal. Hoewel de werkelijke percentages van GFP-positieve cellen kan van experiment om te experimenteren, de verhouding van GFP-positieve cellen veranderen na BRCA1 uitputting ten opzichte van de controle uitputting binnen een experiment is vrij consistent. We normaliseren resultaten door het instellen van de ongeremde succespercentage tot 100% en express resultaten met BRCA1 depleties en voeg-backs als percentages. Op deze manier kunnen we combineren meerdere experimenten, en de experimentele variatie is niet hoog.
Voeg achterkant van BRCA1 mutanten tot nu toe hebben opgeleverd robuuste resultaten: elke BRCA1 variant is ofwel volledig homologe recombinatie gerestaureerd activiteiten of heeft geen effect gehad. Een belangrijke overweging bij het verkrijgen van deze resultaten is dat onze transfectie voorwaarden niveaus van BRCA1-eiwit dat ongeveer gelijk zijn aan de concentratie van het endogene eiwit in onbehandelde cellen te produceren. Een te hoog van een overexpressie van zelfs een gebrekkige mutant van BRCA1 kan leiden tot een aantal positieve homologe recombinatie activiteit.
Een probleem dat we nodig hadden om te overwinnen was de toxiciteit van transfectie. Uitputting van BRCA1 zelf kunnen vertragen celgroei, en het saldo van Lipofectamine-2000 en plasmide DNA ten opzichte van het aantal cellen op de schotel moet worden gehouden op een constant niveau. Te veel Lipofectamine of plasmide-DNA zal verminderen cel nummers, en het aantal cellen zal onvoldoende zijn om betrouwbare flow cytometrie resultaten te verkrijgen. Het saldo van de plasmide en Lipofectamine reagentia ten opzichte van het aantal getransfecteerde cellen is heel belangrijk voor het behoud van de levensvatbaarheid van de cellen.
Figuur 1. Recombinatie substraat. De strategie die was ontwikkeld door de groep van M. Jasin 7,12 is afgebeeld. De PDR-GFP plasmide bevat twee defecte allelen van GFP, waarvan het ene een I-SCEI restrictie endonuclease site. Een HeLa afgeleid cellijn bevat deze DNA-substraat geïntegreerd op een enkele plaats in het genoom 9, en actieve reparatie van de double-stranded DNA pauze op de I-SCEI site door homologe recombinatie resulteert in de omzetting van een allel voor GFP-positieve.
Figuur 2. Detectie van GFP-positieve cellen door fluorescentie microscopie. Cellen werden getest per dit protocol, en controle-uitgeputte cellen actief waren in homologe recombinatie, zoals gedetecteerd door een hoog percentage cellen met GFP expressie (links). Uitputting van BRCA1 door RNAi resulteert in een scherpe daling van het aantal GFP-positieve cellen (rechts).
Figuur 3. Resultaten van een add-back van BRCA1 missense mutanten. Resultaten van een enkel experiment worden getoond in dit histogram. Bij het ontbreken van getransfecteerde I-SCEI uiten plasmide (laan 1) zijn er geen gevonden GFP-positieve cellen. De resultaten in lanen 2-6 waren allemaal afkomstig uit cellen waarin de I-SCEI expressie plasmide werd getransfecteerd op dag 3. In cellen die waren uitgeput voor een irrelevante gen (luciferase) en met vector add-back, 15,5% van de cellen werden GFP-positieve (laan 2). Uitputting van BRCA1 en vector add-back toont het effect van het verlies van BRCA1 op homologe recombinatie (laan 3). De effecten van de uitputting van BRCA1 en add-achterkant van de wild-type BRCA1 (laan 4), BRCA1 (M18T) (baan 5), en BRCA1 (I21V) (baan 6) worden weergegeven. Deze resultaten zijn afkomstig uit een enkel experiment, en zou worden gecombineerd met ten minste twee meer herhalen experimenten in om een maatregel van de homologe recombinatie wordt ondersteund door een bepaalde mutant BRCA1 eiwit te verkrijgen.
Discussion
Het voordeel van deze methode is dat we de functie van het BRCA1-eiwit studie in het reguleren van DNA-herstel door homologe recombinatie met behulp van cellen die wild-type endogeen tot expressie BRCA1 hebben. We hebben twee verschillende methoden voor de studie van de homologe recombinatie proces en van het gebruik van RNAi-gemedieerde uitputting van de nieuwe methode voor het testen van BRCA1-varianten voor functie bij DNA-herstel te verkrijgen. De sleutel voor het succes van deze methode was om een gemakkelijk transfectable cellijn, zoals HeLa vast te stellen, met de recombinatie substraat in het genoom zodanig dat we een zeer hoge niveaus van GFP conversie te verkrijgen. We hadden gescreend meerdere klonen van de oorspronkelijke transformatie om naar een die geen detecteerbare achtergrond GFP signaal had te verkrijgen, maar op transfectie van de I-SCEI expressieplasmide had een zeer hoog niveau van GFP conversie.
Met deze methode, zijn we nu onderzoek naar andere specifieke BRCA1 aminozuren voor functie in homologe recombinatie. Samen met de biologische inzichten uit dit werk, kunnen deze conclusies worden toegepast op de klinische genetica van kanker. Een hoog percentage van de BRCA1 missense mutaties onbekende klinische betekenis omdat er vele zeldzame varianten en er is onvoldoende informatie voor veel van deze vereniging om de kanker te bepalen door genetische segregatie analyse 3,10,13,14. Met behulp van deze methode zouden de gevolgen van een specifieke variant op de biologische functie van BRCA1 bij het reguleren van homologe recombinatie worden gebruikt om vrouwen die een van deze varianten dragen in hun genoom te informeren.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We zijn dankbaar aan de Ohio State University Comprehensive Cancer Center voor het verstrekken van financiering voor dit werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11960 | |
| FBS | USA Scientific, Inc. | 9871-5200 | |
| siRNA | Invitrogen | N/A | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668 | |
| TrypLE | Invitrogen | 12604 | |
| Puromycin | Enzo Life Sciences | BML-GR312 | |
| Opti-MEM I | Invitrogen | 31985 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360 | |
| GlutaMAX I | Invitrogen | 35050 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |
References
- Carvalho, M. A. Determination of cancer risk associated with germ line BRCA1 missense variants by functional analysis. Cancer Res. 67, 1494-1501 (2007).
- Couch, F. J. Genetic epidemiology of BRCA1. Cancer Biol Ther. 3, 509-514 (2004).
- Couch, F. J. Assessment of functional effects of unclassified genetic variants. Hum Mutat. 29, 1314-1326 (2008).
- Tomlinson, G. E. Characterization of a breast cancer cell line derived from a germ-line BRCA1 mutation carrier. Cancer Res. 58, 3237-3242 (1998).
- Ruffner, H., Joazeiro, C. A., Hemmati, D., Hunter, T., Verma, I. M. Cancer-predisposing mutations within the RING domain of BRCA1: loss of ubiquitin protein ligase activity and protection from radiation hypersensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 5134-5139 (2001).
- Moynahan, M. E., Chiu, J. W., Koller, B. H., Jasin, M. Brca1 controls homology-directed DNA repair. Mol Cell. 4, 511-518 (1999).
- Nakanishi, K. Human Fanconi anemia monoubiquitination pathway promotes homologous DNA repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1110-1115 (2005).
- Pierce, A. J. Double-strand breaks and tumorigenesis. Trends Cell Biol. 11, 52-59 (2001).
- Ransburgh, D. J., Chiba, N., Ishioka, C., Toland, A. E., Parvin, J. D. Identification of breast tumor mutations in BRCA1 that abolish its function in homologous DNA recombination. Cancer Res. 70, 988-995 (2010).
- Easton, D. F. A systematic genetic assessment of 1,433 sequence variants of unknown clinical significance in the BRCA1 and BRCA2 breast cancer-predisposition genes. Am J Hum Genet. 81, 873-883 (2007).
- Snouwaert, J. N. BRCA1 deficient embryonic stem cells display a decreased homologous recombination frequency and an increased frequency of non-homologous recombination that is corrected by expression of a brca1 transgene. Oncogene. 18, 7900-7907 (1999).
- Pierce, A. J., Hu, P., Han, M., Ellis, N., Jasin, M. Ku DNA end-binding protein modulates homologous repair of double-strand breaks in mammalian cells. Genes Dev. 15, 3237-3242 (2001).
- Spearman, A. D. Clinically applicable models to characterize BRCA1 and BRCA2 variants of uncertain significance. J Clin Oncol. 26, 5393-5400 (2008).
- Sweet, K., Senter, L., Pilarski, R., Wei, L., Toland, A. E. Characterization of BRCA1 ring finger variants of uncertain significance. Breast Cancer Res Treat. 119, 737-743 (2009).
