Summary
Biz RNAi kullanarak bir hücrenin endojen BRCA1 protein tüketen ve bir kodlama değişiklik içeren bir BRCA1 noktası mutant yerine homolog rekombinasyon DNA hasarı tamir için bir doku kültürü bazlı analiz BRCA1 varyantları test etmek için bir yöntem sağlar.
Abstract
Missense mutasyon, fonksiyonel analiz endojen protein hücre varlığı ile karmaşık olabilir. BRCA1 yapı-işlev analizleri, tam uzunlukta BRCA1 protein ve hypomorphic BRCA1 protein 1,2,3,4,5 ifade hücre hatları ile çalışan doğasında zorluklar için sağlam bir tahlil eksikliği ile komplike olmuştur . Biz bir hücreye endojen BRCA1 protein akut BRCA1 mRNA 3'-UTR hedefleyen RNAi tükenmiş ve bir plazmid BRCA1 varyant ifade co-transfecting yerini sayede bir sistem geliştirdi. Bu prosedürün bir avantajı BRCA1 ve eş zamanlı yedek akut susturulması hücreleri BRCA1 fonksiyon kaybı telafi etmek için zaman içinde ortaya çıkabilecek ikincil mutasyonlar veya uyarlamalar olmadan büyümeye izin veren. Bu tükenmesi ve add-back işlemi kolayca homolog rekombinasyon aktivite için test HeLa kaynaklı hücre hattı yapıldı. Homolog rekombinasyon tahlil rekombinasyon substrat genom (Şekil 1) 6,7,8,9 entegre sayede daha önce yayınlanmış bir yöntem dayanmaktadır . Bu rekombinasyon substrat etkin olmayan bir GFP allel içinde nadir kesim I-SCEI restriksiyon enzimi sitesi ve aşağı ikinci bir inaktif GFP allel. Homolog rekombinasyon tarafından tamir edilebilir çift iplikli bir ara, I-SCEI sonuçları ifade ve homolog rekombinasyon ara tamir eğer kolayca GFP protein ekspresyonu için flow sitometri tarafından atılırsa aktif bir GFP allel oluşturur plazmid, Transfeksiyon . Endojen BRCA1 tükenmesi homolog rekombinasyon aktivite 8-10 kat azalma ve vahşi-tip plazmid tam homolog rekombinasyon fonksiyonu restore add-back. Belirli bir noktaya tam uzunlukta BRCA1 mutantlar co-transfekte plazmid ifade edildi, özel missense mutant etkisi atılır. Bir örnek olarak, BRCA1 (M18T) protein, bilinmeyen bir klinik önemi 10 varyant, ifade, bu hücrelerin de ifade edildi, homolog rekombinasyon BRCA1-bağımlı geri yüklemek için başarısız oldu . Bilinmeyen bir önemi de başka bir versiyonudur kontrast, ifade, BRCA1 (I21V) tam BRCA1 bağımlı homolog rekombinasyon fonksiyonu restore. BRCA1 missense mutasyon fonksiyon testleri Bu strateji centrosome fonksiyonu (Kais ve ark, yayınlanmamış gözlemler) assaying başka bir biyolojik sistemi tatbik edilmiştir. Genel olarak, bu yaklaşım, resesif analiz edilmelidir herhangi bir gen missense mutantların analizi için uygundur.
Protocol
1. Entegre Rekombinasyon Yüzey Hücre Hattı
- HeLa hücreleri PDR-GFP (M. Jasin, Memorial Sloan-Kettering Kanser Merkezi'nden plazmid hediye 7) ile stabil bir şekilde dönüştürülmüş ve transformants seçimi için puromycin muhafaza edildi.
- Hücreler% 10 fetal sığır serumu, 2 mM GlutaMAX, 1 mM sodyum piruvat, penisilin / streptomisin (100 U / mL/0.1 mg / ml), ve 1.5 ug / ml puromycin içeren DMEM / FBS geçişli.
Plazmid ve istikrarlı transformants PDR-GFP rekombinasyon substrat, GFP iki inaktif allel (Şekil 1) içerir. Bir allel I-SCEI 18 bp restriksiyon enzimi tanıma sitesi kodlama sırayla dahil edilmesi nedeniyle devre dışı. Bu hücrelerin I-SCEI İfade çift iplikli DNA sonu (DSB) oluşturur. Bu DNA'nın inaktif GFP ikinci bir allel var, ama ilk allel I-SCEI site ile ilişkili, dizisi kısmını vahşi türüdür. Bu ikinci GFP allel DSB homolog rekombinasyon tamiri için bir dizi donör olarak işlev görebilir ve flow sitometri ile kolayca tespit aktif bir GFP allel neden olacaktır. Alternatif olarak, DSB nonhomologous I-SCEI kısıtlama yok ve GFP-negatif hücreler neden olur, sonunda katılmayı tarafından tamir edilebilir. Bir hücre homolog rekombinasyon GFP pozitif hücrelerin yüzdesi sayarak belirlenir.
Bu hücre hattı, pHeLa-DR13-9, sıfır arka plan GFP sinyal ve plazmid, pCBASce ifade I-SCEI transfeksiyon üzerine GFP pozitif hücrelerin nispeten yüksek bir yüzdesi tüm klonlar arasında seçildi. (PCBASce ve vektör kontrol, pCAGGS, M. Jasin Memorial Sloan-Kettering Kanser Merkezi tarafından sağlandı.)
HeLa-DR13-9 hücre hattı talebi üzerine yazarları mevcuttur.
2. Transfeksiyon Endojen BRCA1 İncelten ve Geri Mutant BRCA1 ekle.
- , Ilk transfeksiyon önce (genellikle Salı) günü: 10 cm çanak HeLa-DR13-9 hücreleri en az% 90 konfluent başlayın.
- 1 mL Trypsinize ve 9 mL DMEM / FBS ekleyerek reaksiyonu durdurmak, pipetleme ile iyice karıştırın.
- 40 mcL başına iyi bir 24 plaka 0.5 mL DME / FBS tripsinize hücreleri ekleyin.
- Gün 1 transfections (Çarşamba): daha az baştan başlamak hücreleri, ~% 40-50 birleşmiş olmalıdır. Transfect karıştırılarak: 5 pmol siRNA + 12.5 mcL Opti-MEM 0.3 ug plazmid DNA ifade BRCA1-mutant ve 12.5 mcL Opti-MEM 0.5 mcL Lipofectamine 2000. Lipofectamine protokolü (Invitrogen) göre transfeksiyon ile devam edin.
- Medya 4-6 saat sonra değiştirin. BRCA1 tüketmek için kullandığınız siRNA belirterek BRCA1 3'-UTR dizileri 80.780 - 80.798 (katılım sayısı AY273801) dizisi GCUCCUCUCACUCUUCAGU dayanmaktadır.
- 2. Gün: 6 plaka, 24 plaka trypsinizing hücrelere aktarın.
- 3. Gün transfections: 25 pmol siRNA + 0.75 ug plazmid DNA ifade BRCA1 mutant 62.5 mcL Opti-MEM ve 62.5 mcL Opti-MEM 2.5 mcL Lipofectamine 2000 + 0.75 ug pCBASce (veya pCAGGS vektör kontrolü). Medya 4-6 saat sonra değiştirin.
3. Transfektanları, analizi.
- 6 gün, her bir kuyudan hücreleri trypsinize ve 1 ml DMEM / FBS durdurmak. GFP ifade hücreleri incelendiğinde, 5 veya 7 gün yapılabilir, ama biz 6 eserleri o günün en iyi bulmak olabilir.
- Flow sitometri ile ortalama 10.000 hücre analiz edin. Ohio State Üniversitesi Kapsamlı Kanser Merkezi Analitik Sitometri paylaşılan kaynak Becton Dickinson FACSCalibur enstrüman kullanın. Tek, canlı hücreleri ileri ve yan dağılım parametreleri kullanarak kapılı. GFP pozitif hücrelerin GFP floresan dedektör (FL1) kullanılarak tespit edilir ve sonuçları bir histogram (Şekil 2, alt) olarak sunulmuştur.
- Sol içinde hücreler, istenirse floresan mikroskobu fotoğrafçılığı için replated olabilir.
4. Temsilcisi Sonuçlar:
BRCA1 homolog rekombinasyon 6,11 çift zincirli DNA kırıkları tamir için yolu düzenler. Homolog rekombinasyon onarım geçiren bu hücrelerin kolayca floresan mikroskobu (Şekil 2, üst) tarafından tespit edilir. BRCA1 sonuçları tespit GFP pozitif hücreler (Şekil 2, sağ) bir azalma tükenmesi. FACSCalibur çıktı, X ekseni ve Y ekseni (Şekil 2, alt) hücrelerinin sayısı, hücre başına GFP yoğunluğu ile bir histogram. Tipik bir tek bir deney sonuçları seti, hücrelerin% 15.5 I-SCEI ifade ve kontrol RNAi tükenmesi (Şekil 3) sonra GFP pozitif. Buna karşılık, BRCA1 ve vektör tükenmesi% 0.7 geri GFP-dönüşüm azalır ekleyin. Add-back yabani tip BRCA 1 veya BRCA 1 (I21V) tamamen restore homolog rekombinasyon,% 15-16 oranında, GFP-pozitif hücrelerin elde algılandı. BRCA1 (M1 add-back8T) mutant (Şekil 3, şerit 5), vektör kontrol add-back olarak benzer bir etkisi vardı. Bu varyant 9 endojen protein olarak benzer seviyelerde ifade beri, biz böylece BRCA1 (M18T) varyant homolog rekombinasyon fonksiyonel olmayan yorumlamak.
Biz genellikle I-SCEI ifade plazmid transfecting sonra GFP pozitif dönüştürmek hücrelerin% 10-20 var. BRCA1, tükenmesi tekrarlanabilir, yaklaşık 8-10 kat GFP pozitif hücrelerin dönüşüm azaltır. GFP pozitif hücreler gerçek yüzdeleri, bir deney içinde kontrol tükenmesi göre BRCA1 tükenmesi deney deney, GFP pozitif hücrelerin oranı değişebilir rağmen oldukça tutarlıdır. Biz sınır tanımayan dönüşüm oranı% 100 ve yüzde olarak BRCA1 tükenişleri ve eklenti sırtlarını ifade sonuçları ayarlayarak sonuçları normalleştirmek. Bu şekilde, birden fazla deneyler birleştirmek ve deneysel bir varyasyon yüksek değildir.
Şimdiye kadar sağlam sonuçlar vermiştir BRCA1 mutantlar geri ekleyin: her varyant BRCA1 ya tam homolog rekombinasyon aktivite geri ya da herhangi bir etkisi olmuştur. Bu sonuçların elde edilmesinde önemli bir göz transfeksiyon koşulları tedavi edilmezse hücrelerinde endojen protein konsantrasyonu yaklaşık eşit BRCA1 protein seviyeleri üretmek. BRCA1 bile kusurlu bir mutant bir aşırı ekspresyonu çok yüksek bazı olumlu homolog rekombinasyon aktivite neden olabilir.
Üstesinden gelmek için gerekli bir sorun transfeksiyon toksisitesi oldu. BRCA1 kendisi tükenmesi yavaş hücre büyümesi ve çanak hücrelerinin sayısına göre Lipofectamine-2000 ve plazmid DNA dengesi, tutarlı bir düzeyde tutulmalıdır. Çok fazla Lipofectamine veya plazmid DNA, hücre sayısını azaltmak ve hücrelerin sayısı, güvenilir flow sitometri sonuçları elde etmek için yetersiz olacaktır. Transfekte hücrelerinin sayısı karşısında plazmid ve Lipofectamine reaktiflerin denge hücreleri canlılığını korumak için oldukça önemlidir.
Şekil 1 rekombinasyon substrat. M. Jasin 7,12 grubu tarafından geliştirilen strateji tasvir edilmiştir. PDR-GFP plazmid I-SCEI kısıtlama endonükleaz site içermektedir biri GFP iki hatalı allel içerir. Bir HeLa kaynaklı hücre hattı, bu DNA, tek bir genom 9 yerinde entegre substrat ve aktif onarım, GFP-pozitif bir allel dönüşüm homolog rekombinasyon sonuçları I-SCEI yerinde çift iplikli DNA sonu içerir.
Şekil 2 floresan mikroskopi GFP pozitif hücrelerin tespiti. Hücreler bu protokol uyarınca, test ve kontrol tükenmiş hücreleri GFP ifade (solda) ile hücreler gibi yüksek bir oranda tespit, homolog rekombinasyon aktif. GFP pozitif hücreler (sağda) sayısında keskin bir düşüş RNAi sonuçlarına göre BRCA1 tükenmesi.
Şekil 3 BRCA1 missense mutantlar bir add-back Sonuçları. Bu histogramda tek bir deney sonuçları gösterilmiştir. Plazmid ifade transfekte I-SCEI yokluğu (şeritli 1) tespit hiçbir GFP pozitif hücreler vardır. Plazmid ifade I-SCEI 3. gününde transfekte edildiği hücrelerde şerit 2-6 sonuçlar alınmıştır. Ilgisiz bir gen (lusiferaz) tükenmiş ve vektör add-back, hücrelerin% 15.5 (şeritli 2), GFP pozitif hücreler. BRCA1 ve vektör tükenmesi add-back homolog rekombinasyon BRCA1 kaybı etkisi (şeritli 3) ortaya koymaktadır. BRCA1 tükenmesi ve yabani tip BRCA1 (şerit 4), BRCA1 (M18T) (şeritli 5), BRCA1 (I21V) (şeritli 6) add-back etkileri gösterilmiştir. Bu sonuçlar, tek bir deney, homolog rekombinasyon, belirli bir mutant BRCA1 protein tarafından desteklenen bir önlem alabilmek için en az iki veya daha fazla tekrar deneyleri ile birlikte olacaktır.
Discussion
Bu yöntemin avantajı, yabani tip endojen ifade BRCA1 hücreleri kullanılarak homolog rekombinasyon DNA onarımı düzenleyen BRCA1 protein fonksiyonu çalışma. Biz iki ayrı kurulmuş yöntemleri homolog rekombinasyon sürecinin eğitim ve DNA tamir fonksiyonu için BRCA1 varyantları test etmek için yeni bir yöntem elde etmek için RNAi-aracılı tükenmesi kullanan kabul ettiler. Bu yöntemin başarısı için anahtar GFP dönüşüm çok yüksek düzeyde elde böyle genom rekombinasyon substrat gibi HeLa gibi kolay transfectable bir hücre hattı kurmak oldu. Saptanabilir arka plan GFP sinyali elde etmek için birden fazla klonlar orijinal dönüşüm elenmiş, ama plazmid I-SCEI ifade transfeksiyon üzerine GFP dönüşüm çok yüksek bir düzeyi vardı.
Bu yöntem ile, şimdi homolog rekombinasyon fonksiyonu için diğer özel BRCA1 amino asit kalıntıları araştırıyoruz. Bu çalışma, biyolojik anlayışlar ile birlikte, bu sonuçlara klinik kanser genetiği uygulanabilir. BRCA1 missense mutasyon yüzdesi yüksek, çok nadir varyantları vardır beri bilinmeyen klinik önemi vardır ve bu çok genetik segregasyon analizi 3,10,13,14 kanseri ilişkiyi belirlemek için yeterli bilgi yoktur . Bu yöntemi kullanarak, BRCA1 homolog rekombinasyon düzenleyen biyolojik işlevi belirli bir varyant sonuçlarını kendi genomunda bu varyantlarının bir taşıyan kadınları bilgilendirmek için kullanılabilir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz bu iş için fon sağlamak için Ohio State Üniversitesi Kapsamlı Kanser Merkezi'nde minnettarız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11960 | |
| FBS | USA Scientific, Inc. | 9871-5200 | |
| siRNA | Invitrogen | N/A | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668 | |
| TrypLE | Invitrogen | 12604 | |
| Puromycin | Enzo Life Sciences | BML-GR312 | |
| Opti-MEM I | Invitrogen | 31985 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360 | |
| GlutaMAX I | Invitrogen | 35050 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |
References
- Carvalho, M. A. Determination of cancer risk associated with germ line BRCA1 missense variants by functional analysis. Cancer Res. 67, 1494-1501 (2007).
- Couch, F. J. Genetic epidemiology of BRCA1. Cancer Biol Ther. 3, 509-514 (2004).
- Couch, F. J. Assessment of functional effects of unclassified genetic variants. Hum Mutat. 29, 1314-1326 (2008).
- Tomlinson, G. E. Characterization of a breast cancer cell line derived from a germ-line BRCA1 mutation carrier. Cancer Res. 58, 3237-3242 (1998).
- Ruffner, H., Joazeiro, C. A., Hemmati, D., Hunter, T., Verma, I. M. Cancer-predisposing mutations within the RING domain of BRCA1: loss of ubiquitin protein ligase activity and protection from radiation hypersensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 5134-5139 (2001).
- Moynahan, M. E., Chiu, J. W., Koller, B. H., Jasin, M. Brca1 controls homology-directed DNA repair. Mol Cell. 4, 511-518 (1999).
- Nakanishi, K. Human Fanconi anemia monoubiquitination pathway promotes homologous DNA repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1110-1115 (2005).
- Pierce, A. J. Double-strand breaks and tumorigenesis. Trends Cell Biol. 11, 52-59 (2001).
- Ransburgh, D. J., Chiba, N., Ishioka, C., Toland, A. E., Parvin, J. D. Identification of breast tumor mutations in BRCA1 that abolish its function in homologous DNA recombination. Cancer Res. 70, 988-995 (2010).
- Easton, D. F. A systematic genetic assessment of 1,433 sequence variants of unknown clinical significance in the BRCA1 and BRCA2 breast cancer-predisposition genes. Am J Hum Genet. 81, 873-883 (2007).
- Snouwaert, J. N. BRCA1 deficient embryonic stem cells display a decreased homologous recombination frequency and an increased frequency of non-homologous recombination that is corrected by expression of a brca1 transgene. Oncogene. 18, 7900-7907 (1999).
- Pierce, A. J., Hu, P., Han, M., Ellis, N., Jasin, M. Ku DNA end-binding protein modulates homologous repair of double-strand breaks in mammalian cells. Genes Dev. 15, 3237-3242 (2001).
- Spearman, A. D. Clinically applicable models to characterize BRCA1 and BRCA2 variants of uncertain significance. J Clin Oncol. 26, 5393-5400 (2008).
- Sweet, K., Senter, L., Pilarski, R., Wei, L., Toland, A. E. Characterization of BRCA1 ring finger variants of uncertain significance. Breast Cancer Res Treat. 119, 737-743 (2009).
