Summary
Мы предлагаем метод тестирования BRCA1 варианты в ткани культуры, основанной тест для гомологичной рекомбинации ремонт повреждения ДНК за счет истощения эндогенного белка BRCA1 из ячейки с помощью РНК-интерференции и заменить его мутантом BRCA1, который содержит точку кодирования изменения.
Abstract
Функциональный анализ миссенс мутации могут быть осложнены присутствием в ячейке эндогенного белка. Структурно-функциональных анализов BRCA1 были осложнены отсутствием надежных тест для полного белка BRCA1 длины и трудности, присущие в работе с клеточными линиями, которые выражают hypomorphic белка BRCA1 1,2,3,4,5. Мы разработали систему, согласно которой эндогенные белки BRCA1 в камере остро истощены RNAi ориентации 3'-UTR из мРНК гена BRCA1 и заменены совместной трансфекции плазмиды выражения BRCA1 вариант. Одно из преимуществ этой процедуры является то, что острые глушителей замены BRCA1 и одновременное позволяют клеткам расти без вторичных мутаций или адаптации, которые могут возникнуть с течением времени, чтобы компенсировать потерю BRCA1 функции. Это истощение и дополнения процедуру обратного было сделано в HeLa производные клеточной линии, которая была с готовностью анализировали на гомологичной рекомбинации деятельности. Гомологичной рекомбинации анализ основан на ранее опубликованные метод, посредством рекомбинации подложку интегрированы в геном (рис. 1) 6,7,8,9. Это рекомбинации субстрат обладает редким резки I-SCEI рестриктазы сайт внутри неактивного аллель GFP, и вниз по течению, вторая аллель неактивных GFP. Трансфекция плазмиды, что выражает I-SCEI приводит к двухцепочечной перерыва, которые могут быть устранены путем гомологичной рекомбинации, и если гомологичной рекомбинации делает ремонт сломать это создает активные аллели GFP, который легко забил с помощью проточной цитометрии для экспрессии белка GFP . Истощение эндогенного BRCA1 привело к 8-10-кратное снижение гомологичной рекомбинации деятельности, а также добавить-обратно дикого типа плазмид полностью восстановлено гомологичной рекомбинации функции. Когда конкретные мутанты точки полную длину BRCA1 была выражена из совместной трансфекции плазмиды, влияние конкретных мутант миссенс может быть засчитан. Например, выражение BRCA1 (M18T) белка, вариант неизвестного клинического значения 10, была выражена в этих клетках, она не смогла восстановить BRCA1-зависимых гомологичной рекомбинации. С другой стороны, выражение другом варианте, также неизвестного значения, BRCA1 (I21V) полностью восстановлено BRCA1-зависимых гомологичной рекомбинации функции. Эта стратегия тестирования функции BRCA1 мутаций миссенс была применена в другой биологической системы опробования для центросомы функции (Кайс и др., неопубликованные данные). В целом, такой подход пригоден для анализа миссенс мутантов в любой ген, который должен быть проанализирован рецессивно.
Protocol
1. Клеточной линии с комплексной Субстрат Рекомбинация
- HeLa клетки стабильно трансформированные PDR-GFP (плазмиды 7 подарок от М. Jasin, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center) и поддерживается в пуромицин отбора трансформантов.
- Клетки пассировать в DMEM / FBS, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ GlutaMAX, 1 мМ пирувата натрия, пенициллина / стрептомицина (100 U / mL/0.1 мг / мл) и 1,5 мкг / мл пуромицин.
Рекомбинации субстрата в PDR-GFP плазмиды, и в стабильных трансформантах, содержит два неактивных аллелей GFP (рис. 1). Один аллель неактивными из-за включения в его кодирующей последовательности из 18 б.п. рестриктазы сайт узнавания для I-SCEI. Выражение I-SCEI в этих клетках создает двухцепочечной ДНК брейк (DSB). Существует второй аллель неактивных GFP на этой ДНК, но часть ее последовательность коррелирует с I-SCEI сайт на первые аллель дикого типа. Это вторая аллель GFP может функционировать как последовательность доноров для гомологичной рекомбинации ремонт DSB и приведет к активным аллелем GFP, который легко обнаружить с помощью проточной цитометрии. Кроме того, DSB могут быть устранены путем негомологичных конечного присоединения, которая разрушила бы I-SCEI сайт рестрикции и приведет к GFP-отрицательные клетки. Уровень гомологичной рекомбинации в клетке определяется путем подсчета доли GFP-положительных клеток.
Эта клеточная линия, pHeLa-DR13-9, был выбран среди всех клонов на нулевом фоне сигнала GFP и относительно высокий процент GFP-положительных клеток после трансфекции с I-SCEI выражения плазмиды, pCBASce. (PCBASce и его борьбы с переносчиками, pCAGGS, оба поставляются М. Jasin из Memorial Sloan-Kettering Cancer Center).
HeLa-DR13-9 клеточной линии можно получить у авторов по запросу.
2. Трансфекция к разрушающим Эндогенные BRCA1 и Добавить Перейти Мутант BRCA1.
- Накануне первого трансфекции (как правило, вторник): Начните с 10 см блюдо HeLa-DR13-9 клетках не менее 90% вырожденная.
- Trypsinize в 1 мл и остановить реакцию добавлением 9 мл DMEM / FBS, хорошо перемешать с помощью пипетки.
- Добавить 40 мкл трипсинизировали клеток на лунку в 24-луночный планшет в 0,5 мл DME / FBS.
- День 1 трансфекции (среда): клетки должны быть ~ 40-50% вырожденным, если намного меньше начать все сначала. Трансфекции путем смешивания: 5 пмоль миРНК + 0,3 мкг BRCA1-мутант выражения плазмидной ДНК в 12,5 мкл Opti-MEM; и 0,5 мкл Lipofectamine 2000 года в 12,5 мкл Opti-MEM. Приступить к трансфекции в соответствии с протоколом Lipofectamine (Invitrogen).
- Замените СМИ 4-6 часов спустя. МиРНК мы используем, чтобы истощать BRCA1 основывается на последовательности GCUCCUCUCACUCUUCAGU указанием BRCA1 3'-UTR последовательности 80780 до 80798 (регистрационный номер AY273801).
- День 2: Трансфер клеток trypsinizing из 24-луночный планшет с 6 лунками.
- День 3 трансфекции: 25 пмоль миРНК + 0,75 мкг BRCA1-мутант выражения плазмидной ДНК + 0,75 мкг pCBASce (или pCAGGS векторное управление) в 62,5 мкл Opti-MEM и 2,5 мкл Lipofectamine 2000 года в 62,5 мкл Opti-MEM. Замените СМИ 4-6 часов спустя.
3. Анализ трансфектантов.
- На 6-й день, trypsinize клетки из каждой лунки и остановить в 1 мл DMEM / FBS. Анализ клеток для GFP выражение может быть сделано в дни, 5 или 7, но мы находим, что 6-й день работает лучше всего.
- Анализ 10 000 клеток на лунку с помощью проточной цитометрии. Мы используем Becton Dickinson FACSCalibur инструментом в государственном университете Огайо Всесторонний Онкологический центр аналитического ресурса цитометрии совместно. Событие на живые клетки закрытого использованием прямой и боковой параметров разброс. GFP-положительных клеток определяются с использованием детектора флуоресценции GFP (FL1), а результаты представлены в виде гистограммы (рис. 2, внизу).
- Остатки клетки могут быть replated для фотографии флуоресцентной микроскопии, при желании.
4. Представитель Результаты:
BRCA1 регулирует пути для ремонта разрывов двухцепочечной ДНК с помощью гомологичной рекомбинации 6,11. Те клетки, которые прошли ремонт гомологичной рекомбинации легко обнаружить флуоресцентной микроскопии (рис. 2, вверху). Истощение BRCA1 приводит к снижению обнаружены GFP-положительных клеток (рис. 2, справа). Выход из FACSCalibur является гистограмма с GFP интенсивности на ячейку на оси Х и число клеток на оси ординат (рис. 2, внизу). В типичный набор результаты одного эксперимента, 15,5% клеток были GFP-положительных после I-SCEI выражения и контроля RNAi истощения (рис. 3). Для сравнения, истощение BRCA1 и векторных добавить обратно уменьшается GFP-преобразования до 0,7%. Дополнения назад дикого типа BRCA1 или BRCA1 (I21V) полностью восстановлено гомологичной рекомбинации, так как обнаружено, получая 15-16% GFP-положительных клеток. Дополнения задней BRCA1 (M18Т) мутант (рис. 3, дорожка 5) были же эффект, как надстройки задней переносчиками болезней. Так как этот вариант, высказанные на том же уровне, эндогенных белков 9, мы, таким образом интерпретировать BRCA1 (M18T) вариант неработоспособность гомологичной рекомбинации.
Мы как правило, 10-20% клеток преобразовать в GFP-положительных после трансфекции I-SCEI выражение плазмиды. Истощение BRCA1 воспроизводимо снижает преобразования GFP-положительных клеток примерно 8-10 раз. Хотя фактический процент GFP-положительных клеток может меняться от эксперимента к эксперименту, отношение GFP-положительных клеток после BRCA1 истощение по сравнению с контролем истощения в эксперименте вполне последовательна. Мы нормализации результатов, установив раскованно преобразование частоты до 100% и выразить результаты с BRCA1 истощения и дополнения спиной в процентах. Таким образом, мы можем объединить несколько экспериментов, и экспериментальные изменения невелика.
Добавить задней BRCA1 мутанты до сих пор дали надежные результаты: каждый BRCA1 вариант имеет либо полностью восстановлено гомологичной рекомбинации деятельности или имел никакого эффекта. Важным фактором в получении этих результатов является то, что наши условия трансфекции производить уровни BRCA1 белок, который примерно равные концентрации эндогенного белка в необработанных клетках. Слишком большое гиперэкспрессия даже дефектных мутантом BRCA1 могут привести к некоторым положительным гомологичной рекомбинации деятельности.
Проблема, что нам необходимо было преодолеть токсичность трансфекции. Истощение BRCA1 сам может замедлить рост клеток, и баланс Lipofectamine 2000 года и плазмидной ДНК отношению к числу клеток на блюдо должны проводиться на стабильный уровень. Слишком много Lipofectamine или плазмидной ДНК приведет к сокращению числа клеток, и число ячеек будет недостаточно для получения достоверных результатов методом проточной цитометрии. Баланс плазмиды и Lipofectamine реагентов по сравнению с числом клеток, трансфицированных весьма важно для поддержания жизнеспособности клеток.
Рисунок 1. Рекомбинации подложки. Стратегии, которая была разработана группой М. Jasin 7,12 изображен. PDR-GFP плазмида содержит двух дефектных аллелей GFP, один из которых содержит I-SCEI рестриктазы сайт. HeLa производные клеточной линии содержит этот субстрат ДНК интегрированы на одном месте в геноме 9, и активных ремонт двухцепочечной ДНК перерыв в I-SCEI сайта гомологичной рекомбинации приводит превращение одного аллеля GFP-положительных.
Рисунок 2. Обнаружение GFP-положительных клеток путем флуоресцентной микроскопии. Клетки были протестированы в соответствии с этим протоколом, и контрольно-обедненного клетки были активны в гомологичной рекомбинации, так как обнаружены высокий процент клеток с GFP выражение (слева). Истощение BRCA1 по результатам RNAi в резком снижении числа GFP-положительных клеток (справа).
Рисунок 3. Результаты дополнения назад мутантов BRCA1 миссенс. Результаты одного эксперимента представлены на этой гистограмме. При отсутствии трансфицированных I-SCEI выражения плазмиды (полоса 1) Есть не GFP-положительных клеток обнаружено. Результаты на дорожках 2-6 были взяты из клетки, в которых я-SCEI выражения плазмиду трансфицированных на 3 день. В клетках, что были исчерпаны за не имеет значения гена (люциферазы) и с векторной надстройки назад, 15,5% от клетки GFP-положительных (дорожка 2). Истощение BRCA1 и векторных дополнения обратно показывает эффект потери BRCA1 на гомологичной рекомбинации (дорожка 3). Последствия истощения BRCA1 и дополнения назад дикого типа BRCA1 (дорожка 4), BRCA1 (M18T) (дорожка 5), и BRCA1 (I21V) (переулок 6), показано на рисунке. Эти результаты получены для одного эксперимента, и был бы в сочетании с по крайней мере еще два эксперименты повторить, чтобы получить меру гомологичной рекомбинации поддерживает данный мутантный белок BRCA1.
Discussion
Преимуществом этого метода является то, что мы можем изучать функции BRCA1 белков в регуляции репарации ДНК путем гомологичной рекомбинации с использованием клеток, которые дикого типа эндогенно выразил BRCA1. Мы приняли два отдельных установленных методов изучения гомологичной рекомбинации процесса и использования RNAi-опосредованной истощения, чтобы получить новый метод тестирования BRCA1 вариантов для функции в репарации ДНК. Ключ для успеха этого метода заключается в создании легко transfectable клеточной линии, например, HeLa, с рекомбинацией субстрата в геноме, что мы получаем очень высокий уровень преобразования GFP. У нас было несколько экранированных клоны оригинальных преобразования для того, чтобы получить один, который не обнаруживается сигнал GFP фон, но при трансфекции I-SCEI плазмиды экспрессии был очень высокий уровень конверсии GFP.
С помощью этого метода, мы сейчас расследование других конкретных BRCA1 аминокислотных остатков на функцию в гомологичной рекомбинации. Наряду с биологическими выводы из этой работы, эти выводы могут быть применены к клинической генетики рака. Высокий процент мутаций генов BRCA1 миссенс неизвестными клиническое значение, поскольку Есть много редких вариантов и нет достаточной информации для многих из них, чтобы определить рак ассоциацию, генетический анализ сегрегации 3,10,13,14. Используя этот метод, последствия конкретных вариантов по биологической функции BRCA1 в регулировании гомологичной рекомбинации может быть использована для информирования женщин, имеющих одного из этих вариантов в их геноме.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарны Университета штата Огайо Всесторонний Онкологический центр для предоставления финансовых средств для этой работы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11960 | |
| FBS | USA Scientific, Inc. | 9871-5200 | |
| siRNA | Invitrogen | N/A | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668 | |
| TrypLE | Invitrogen | 12604 | |
| Puromycin | Enzo Life Sciences | BML-GR312 | |
| Opti-MEM I | Invitrogen | 31985 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360 | |
| GlutaMAX I | Invitrogen | 35050 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |
References
- Carvalho, M. A. Determination of cancer risk associated with germ line BRCA1 missense variants by functional analysis. Cancer Res. 67, 1494-1501 (2007).
- Couch, F. J. Genetic epidemiology of BRCA1. Cancer Biol Ther. 3, 509-514 (2004).
- Couch, F. J. Assessment of functional effects of unclassified genetic variants. Hum Mutat. 29, 1314-1326 (2008).
- Tomlinson, G. E. Characterization of a breast cancer cell line derived from a germ-line BRCA1 mutation carrier. Cancer Res. 58, 3237-3242 (1998).
- Ruffner, H., Joazeiro, C. A., Hemmati, D., Hunter, T., Verma, I. M. Cancer-predisposing mutations within the RING domain of BRCA1: loss of ubiquitin protein ligase activity and protection from radiation hypersensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 5134-5139 (2001).
- Moynahan, M. E., Chiu, J. W., Koller, B. H., Jasin, M. Brca1 controls homology-directed DNA repair. Mol Cell. 4, 511-518 (1999).
- Nakanishi, K. Human Fanconi anemia monoubiquitination pathway promotes homologous DNA repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1110-1115 (2005).
- Pierce, A. J. Double-strand breaks and tumorigenesis. Trends Cell Biol. 11, 52-59 (2001).
- Ransburgh, D. J., Chiba, N., Ishioka, C., Toland, A. E., Parvin, J. D. Identification of breast tumor mutations in BRCA1 that abolish its function in homologous DNA recombination. Cancer Res. 70, 988-995 (2010).
- Easton, D. F. A systematic genetic assessment of 1,433 sequence variants of unknown clinical significance in the BRCA1 and BRCA2 breast cancer-predisposition genes. Am J Hum Genet. 81, 873-883 (2007).
- Snouwaert, J. N. BRCA1 deficient embryonic stem cells display a decreased homologous recombination frequency and an increased frequency of non-homologous recombination that is corrected by expression of a brca1 transgene. Oncogene. 18, 7900-7907 (1999).
- Pierce, A. J., Hu, P., Han, M., Ellis, N., Jasin, M. Ku DNA end-binding protein modulates homologous repair of double-strand breaks in mammalian cells. Genes Dev. 15, 3237-3242 (2001).
- Spearman, A. D. Clinically applicable models to characterize BRCA1 and BRCA2 variants of uncertain significance. J Clin Oncol. 26, 5393-5400 (2008).
- Sweet, K., Senter, L., Pilarski, R., Wei, L., Toland, A. E. Characterization of BRCA1 ring finger variants of uncertain significance. Breast Cancer Res Treat. 119, 737-743 (2009).
