Wij bieden een methode voor het testen van BRCA1 varianten in een weefselkweek gebaseerde test voor homologe recombinatie reparatie van DNA-schade door afbrekende endogene BRCA1-eiwit uit een cel met behulp van RNAi en te vervangen door een BRCA1-punt mutant die een codering wijzigen.
De functionele analyse van missense mutaties kan worden bemoeilijkt door de aanwezigheid in de cel van de endogene eiwit. Structuur-functie analyse van de BRCA1 werden bemoeilijkt door het ontbreken van een robuuste test voor de volledige lengte BRCA1-eiwit en de moeilijkheden die inherent zijn aan het werken met cellijnen die hypomorphic BRCA1-eiwit 1,2,3,4,5 uit te drukken. We ontwikkelden een systeem waarbij de endogene BRCA1-eiwit in een cel acuut was uitgeput door RNAi gericht op de 3'-UTR van het BRCA1 mRNA en vervangen door co-transfectie een plasmide dat een BRCA1 variant. Een voordeel van deze procedure is dat de acute zwijgen van BRCA1 en gelijktijdige vervanging laat de cellen om te groeien zonder secundaire mutaties of aanpassingen die kunnen ontstaan na verloop van tijd te compenseren voor het verlies van BRCA1-functie. Deze uitputting en voeg-back procedure werd gedaan in een HeLa-afgeleide cellijn die gemakkelijk werd getest op homologe recombinatie activiteit. De homologe recombinatie test is gebaseerd op een eerder gepubliceerde methode waarbij een recombinatie substraat is geïntegreerd in het genoom (Figuur 1) 6,7,8,9. Deze recombinatie substraat heeft de zeldzame-cutting I-SCEI restrictie-enzym plaats in een inactieve GFP-allel, en stroomafwaarts is een seconde inactief GFP-allel. Transfectie van het plasmide, dat I-SCEI resultaten uit in een double-stranded breken, die kan worden gerepareerd door homologe recombinatie, en als homologe recombinatie niet repareren de pauze het creëert een actieve GFP allel dat gemakkelijk wordt gescoord door flowcytometrie voor GFP eiwitexpressie . Uitputting van endogene BRCA1 resulteerde in een 8-10-voudige afname in homologe recombinatie activiteit en add-achterkant van de wild-type plasmide volledig homologe recombinatie gerestaureerd functie. Wanneer specifieke punt mutanten van volledige lengte BRCA1 werden uitgedrukt van co-getransfecteerd plasmiden, kan het effect van de specifieke missense mutant worden gescoord. Als voorbeeld, de expressie van het BRCA1 (M18T) eiwit, een variant van onbekende klinische betekenis 10, werd uitgedrukt in deze cellen, is het niet BRCA1-afhankelijke homologe recombinatie te herstellen. Daarentegen, de expressie van een andere variant, ook van onbekende betekenis, BRCA1 (I21V) volledig gerestaureerd BRCA1-afhankelijke homologe recombinatie functie. Deze strategie van het testen van de functie van BRCA1 missense mutaties is toegepast op een ander biologisch systeem te testen op centrosoom functie (Kais et al., ongepubliceerde waarnemingen). Het geheel genomen is deze aanpak is geschikt voor de analyse van missense mutanten in een gen dat recessief moet worden geanalyseerd.
Het voordeel van deze methode is dat we de functie van het BRCA1-eiwit studie in het reguleren van DNA-herstel door homologe recombinatie met behulp van cellen die wild-type endogeen tot expressie BRCA1 hebben. We hebben twee verschillende methoden voor de studie van de homologe recombinatie proces en van het gebruik van RNAi-gemedieerde uitputting van de nieuwe methode voor het testen van BRCA1-varianten voor functie bij DNA-herstel te verkrijgen. De sleutel voor het succes van deze methode was om een gemakkelijk transfectable cellijn, zoals HeLa vast te stellen, met de recombinatie substraat in het genoom zodanig dat we een zeer hoge niveaus van GFP conversie te verkrijgen. We hadden gescreend meerdere klonen van de oorspronkelijke transformatie om naar een die geen detecteerbare achtergrond GFP signaal had te verkrijgen, maar op transfectie van de I-SCEI expressieplasmide had een zeer hoog niveau van GFP conversie.
Met deze methode, zijn we nu onderzoek naar andere specifieke BRCA1 aminozuren voor functie in homologe recombinatie. Samen met de biologische inzichten uit dit werk, kunnen deze conclusies worden toegepast op de klinische genetica van kanker. Een hoog percentage van de BRCA1 missense mutaties onbekende klinische betekenis omdat er vele zeldzame varianten en er is onvoldoende informatie voor veel van deze vereniging om de kanker te bepalen door genetische segregatie analyse 3,10,13,14. Met behulp van deze methode zouden de gevolgen van een specifieke variant op de biologische functie van BRCA1 bij het reguleren van homologe recombinatie worden gebruikt om vrouwen die een van deze varianten dragen in hun genoom te informeren.
The authors have nothing to disclose.
We zijn dankbaar aan de Ohio State University Comprehensive Cancer Center voor het verstrekken van financiering voor dit werk.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
DMEM | Invitrogen | 11960 | ||
FBS | USA Scientific | 9871-5200 | ||
siRNA | Invitrogen | N/A | ||
Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668 | ||
TrypLE | Invitrogen | 12604 | ||
Puromycin | Enzo Life Sciences | BML-GR312 | ||
Opti-MEM I | Invitrogen | 31985 | ||
Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360 | ||
GlutaMAX I | Invitrogen | 35050 | ||
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |