Wir stellen eine Methode zur Prüfung von BRCA1-Varianten in einer Gewebekultur basierter Assay für die homologe Rekombination Reparatur von DNA-Schäden, die durch abbauende endogenen BRCA1-Protein aus einer Zelle mit RNAi und ersetzt sie mit einer BRCA1 Punktmutante, dass eine Codierung ändern enthält.
Die funktionelle Analyse von Missense-Mutationen können durch die Anwesenheit in der Zelle des endogenen Proteins kompliziert sein. Struktur-Funktions-Analysen des BRCA1 haben durch das Fehlen einer robusten Assay für die volle Länge BRCA1-Protein und die Schwierigkeiten in der Arbeit mit Zelllinien, die hypomorphen BRCA1-Protein 1,2,3,4,5 äußern kompliziert. Wir entwickelten ein System, bei dem endogenen BRCA1-Protein in einer Zelle akut durch RNAi-Targeting der 3'-UTR des BRCA1 mRNA erschöpft war und durch Co-Transfektion eines Plasmids, das eine BRCA1-Variante. Ein Vorteil dieses Verfahrens ist, dass die akute Schweigen der Gene BRCA1 und gleichzeitigen Austausch der Zellen ohne sekundäre Mutationen oder Anpassungen, die im Laufe der Zeit entstehen könnten, um den Verlust von BRCA1-Funktion kompensieren wachsen lassen. Dieser Abbau und Add-back-Verfahren wurde in einem HeLa-derived-Zelllinie, die leicht für die homologe Rekombination Aktivität wurde untersucht getan. Die homologe Rekombination Test basiert auf einem bereits veröffentlichten Methode, bei der eine Rekombination Substrat in das Genom (Abbildung 1) 6,7,8,9 integriert ist. Diese Rekombination Substrat hat die seltene-Schneid I-SceI Restriktionsenzymstelle in einem inaktiven GFP-Allel und nachgeschaltet ist eine zweite inaktive GFP-Allel. Transfektion der Plasmid, das I-SceI Ergebnisse drückt in einem doppelsträngigen Pause, die durch homologe Rekombination repariert werden kann, und wenn homologe Rekombination nicht reparieren der Pause schafft eine aktive GFP-Allel, das ist leicht mittels Durchflusszytometrie für GFP-Protein-Expression erzielt . Depletion von endogenen BRCA1 führte zu einer 8-10-fache Reduktion der homologen Rekombination Aktivität und Hinzurechnung von Wildtyp-Plasmid vollständig restauriert homologe Rekombination Funktion. Wenn bestimmte Punktmutanten in voller Länge BRCA1 von co-transfiziert Plasmiden exprimiert wurden, konnte die Wirkung des spezifischen Missense-Mutanten erzielt werden. Als ein Beispiel, der Ausdruck des BRCA1 (M18T)-Protein, eine Variante des unbekannten klinische Bedeutung 10, in diesen Zellen exprimiert wurde, unterließ es BRCA1-abhängigen homologen Rekombination wiederherstellen. Im Gegensatz dazu Ausdruck einer anderen Variante auch von unbekannter Bedeutung, BRCA1 (I21V) voll BRCA1-abhängigen homologen Rekombination Funktion wiederhergestellt. Diese Strategie der Prüfung der Funktion des BRCA1 Missense-Mutationen wurde in einen anderen biologischen System Testen auf Zentrosomenfunktion (Kais et al, unveröffentlichte Beobachtungen) angewendet worden. Insgesamt ist dieser Ansatz für die Analyse von Missense-Mutanten in einem Gen, das rezessiv analysiert werden müssen.
Der Vorteil dieser Methode ist, dass wir die Funktion des BRCA1-Protein bei der Regulation der DNA-Reparatur durch homologe Rekombination unter Verwendung von Zellen, die Wildtyp-endogen exprimierten Gene BRCA1 haben zu studieren. Wir verfügen über zwei separate etablierten Methoden der Untersuchung der homologen Rekombination und der Nutzung RNAi-vermittelten Abbau der neuartigen Methode zum Testen von BRCA1-Varianten für die Funktion der DNA-Reparatur erhalten hat. Der Schlüssel für den Erfolg dieser Methode war es, eine leicht transfizierbare Zelllinie, wie HeLa etablieren, mit der Rekombination Substrat in das Genom, so dass wir sehr hohe GFP Umsatz zu erreichen. Wir hatten mehrere Klone des ursprünglichen Transformation, um gesiebt, um eine, die keine nachweisbaren Hintergrund GFP-Signal war zu erhalten, sondern auf die Transfektion der I-SceI Expressionsplasmid hatte ein sehr hohes Maß an GFP-Konvertierung.
Mit dieser Methode sind wir nun untersuchen andere spezifische BRCA1 Aminosäurereste für die Funktion in der homologen Rekombination. Zusammen mit der biologischen Erkenntnisse aus dieser Arbeit lassen sich diese Schlussfolgerungen für die klinische Krebsgenetik angewendet werden. Ein hoher Prozentsatz der BRCA1 Missense-Mutationen haben unbekannte klinische Bedeutung, da es viele seltene Varianten und es gibt nicht genügend Informationen für viele dieser, um den Krebs Verein durch genetische Segregationsanalyse 3,10,13,14 zu bestimmen. Mit dieser Methode könnten die Folgen einer spezifischen Variante der biologischen Funktion von BRCA1 bei der Regulierung der homologen Rekombination zur Frauen, die eine dieser Varianten tragen in ihrem Genom zu informieren.
The authors have nothing to disclose.
Wir sind dankbar für die Ohio State University Comprehensive Cancer Center für die Bereitstellung von Mitteln für diese Arbeit.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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DMEM | Invitrogen | 11960 | ||
FBS | USA Scientific | 9871-5200 | ||
siRNA | Invitrogen | N/A | ||
Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668 | ||
TrypLE | Invitrogen | 12604 | ||
Puromycin | Enzo Life Sciences | BML-GR312 | ||
Opti-MEM I | Invitrogen | 31985 | ||
Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360 | ||
GlutaMAX I | Invitrogen | 35050 | ||
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |