Vi erbjuder en metod för att testa BRCA1 varianter i en vävnad kultur baserad analys för homolog rekombination reparation av DNA-skador av ozonnedbrytande endogena BRCA1 protein från en cell med hjälp av RNAi och ersätta den med en BRCA1 punkt mutant som innehåller en kodning förändring.
Den funktionella analysen av missense mutationer kan kompliceras av att det i cellen av endogena protein. Struktur-funktion analyser av BRCA1 har komplicerats av att det saknas en robust analys för fulla längd BRCA1 protein och de inneboende svårigheterna i att arbeta med cellinjer som uttrycker hypomorphic BRCA1 protein 1,2,3,4,5. Vi utvecklade ett system där de endogena BRCA1 protein i en cell blev akut utfiskade av RNAi inriktning på 3'-UTR för BRCA1 mRNA och ersättas av samarbete transfecting en plasmid som uttrycker en BRCA1-variant. En fördel med detta förfarande är att den akuta ljuddämpning av generna BRCA1 och samtidig ersättning låta cellerna att växa utan sekundära mutationer eller anpassningar som kan uppstå med tiden för att kompensera för förlusten av BRCA1 funktion. Denna utarmning och add-back-förfarande gjordes i en HeLa som härrör cellinje som lätt var analyserade för homolog rekombination aktivitet. Den homolog rekombination analysen är baserad på en tidigare publicerad metod där en rekombination substrat är integrerad i arvsmassan (Figur 1) 6,7,8,9. Denna rekombination substrat har den sällsynta skär I-SCEI plats restriktionsenzymanalys inuti en inaktiv GFP-allel, och nedströms en andra inaktiv GFP allel. Transfektion av plasmiden som uttrycker I-SCEI resulterar i en dubbel-strängat paus, som kan repareras av homolog rekombination, och om homolog rekombination inte reparera sönder det skapar en aktiv GFP allel som lätt görs med flödescytometri för GFP protein expression . Utarmning av endogena BRCA1 resulterade i en 8-10-faldig minskning av homolog rekombination aktivitet, och lägga tillbaka av vild-typ plasmid helt återställd homolog rekombination funktion. När specifik punkt mutanter av full längd BRCA1 uttrycktes från co-transfekterade plasmider, kan effekten av den specifika missense mutant görs. Som ett exempel, var ett uttryck för BRCA1 (M18T) protein, en variant av kliniska signifikansen 10, uttryckt i dessa celler, misslyckades den med att återställa BRCA1-beroende homolog rekombination. Däremot uttryck för en annan variant, också av okänd betydelse, BRCA1 (I21V) helt återställd BRCA1-beroende homolog rekombination funktion. Denna strategi för att testa funktionen hos BRCA1 missense mutationer har tillämpats på ett annat biologiskt system testmetoder för centrosome funktion (Kais et al, opublicerade observationer). Sammantaget är denna metod lämplig för analys av missense mutanter i en gen som måste analyseras recessivt.
Fördelen med denna metod är att vi kan studera funktionen hos BRCA1 protein i regleringen av DNA-reparation av homolog rekombination använda celler som har vildtyp endogent uttryckta BRCA1. Vi har antagit två olika etablerade metoder för att studera homolog rekombination processen och utnyttja RNAi-medierad utarmning att få ny metod för att testa BRCA1 varianter för funktion i DNA-reparation. Nyckeln för att lyckas med denna metod var att skapa en lätt transfectable cellinje, såsom HeLa med rekombination substrat i arvsmassan så att vi får mycket höga halter av GFP konvertering. Vi hade skärmade flera kloner av den ursprungliga omvandling för att få en som inte hade någon påvisbar signal bakgrund GFP, utan på transfektion I-SCEI uttryck plasmid hade en mycket hög nivå av GFP konvertering.
Med denna metod undersöker vi nu andra specifika BRCA1 aminosyror för funktion i homolog rekombination. Tillsammans med biologiska insikter från detta arbete, kan dessa slutsatser tillämpas på Clinical Cancer genetik. En stor andel av generna BRCA1 missense mutationer har okända klinisk betydelse eftersom det finns många sällsynta varianter och det finns otillräcklig information för många av dessa för att bestämma cancer föreningen genom genetisk segregering analys 3,10,13,14. Med denna metod kan konsekvenserna av en specifik variant på den biologiska funktionen hos BRCA1 i regleringen av homolog rekombination användas för att informera kvinnor som bär en av dessa varianter i sin arvsmassa.
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma till Ohio State University Comprehensive Cancer Center för att tillhandahålla finansiering för detta arbete.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
DMEM | Invitrogen | 11960 | ||
FBS | USA Scientific | 9871-5200 | ||
siRNA | Invitrogen | N/A | ||
Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668 | ||
TrypLE | Invitrogen | 12604 | ||
Puromycin | Enzo Life Sciences | BML-GR312 | ||
Opti-MEM I | Invitrogen | 31985 | ||
Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360 | ||
GlutaMAX I | Invitrogen | 35050 | ||
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |