Summary
הפרוטוקולים מתארים את הצעדים החיוניים לקבלת איכות עקיפה גבישים של חלבון ממברנה החל הכינון מחדש של החלבון בשלב מעוקב lipidic (LCP), מציאת התנאים הראשוניים עם LCP-FRAP טרום התגבשות מבחני, הגדרת ניסויים התגבשות LCP וקריסטלים קציר .
Abstract
חלבונים ממברנה לבצע פונקציות קריטיות בתאים חיים הקשורים אותות, התמרה התחבורה טרנספורמציות אנרגיה, וככאלה, הם מעורבים במגוון רחב של תקלות ומחלות. עם זאת, הבנה מבניים ותפקודיים של חלבונים בממברנה הוא מאוד מפגר כי השותפים מסיסים שלהם, בעיקר, בשל קשיים הקשורים solubilization שלהם לדור של גבישים באיכות עקיפה. התגבשות ב mesophases lipidic (הידוע גם בשם ב התגבשות טווינה או LCP) היא טכניקה מבטיחה אשר יושמה בהצלחה להשיג מבנים ברזולוציה גבוהה של rhodopsins חיידקים, חלבונים פוטוסינתטיים, החיצוני בטא חביות הממברנה G-חלבון בשילוב קולטנים. בשנת טווינה התגבשות מנצל הסביבה יליד דמוי קרום ובדרך כלל מייצרת גבישי עם תוכן ממס נמוך יותר מזמין לעומת התגבשות מסורתיים פתרונות ניקוי. השיטה היא לא קשה, אבל דורש הבנה של התנהגות השומנים שלב ופרקטיקה בטיפול בחומרים mesophase צמיג. כאן אנו מדגימים דרך פשוטה ויעילה של עשיית LCP ואת ומשחזר חלבון הממברנה ב bilayer השומנים של LCP באמצעות מערבל מזרק, ואחריו מחלק מנות nanoliter של LCP לתוך assay או צלחת התגבשות, ביצוע מבחני טרום התגבשות והקציר גבישים מ המטריצה LCP. פרוטוקולים אלה מספקים מדריך בסיסי מתקרב בניסויים טווינה התגבשות, אולם, כמו כל ניסוי התגבשות, הקרנת נרחב ואופטימיזציה נדרשים, ואת התוצאה המוצלחת אינה מובטחת בהכרח.
Protocol
מתווה טיפוסי בניסוי התגבשות טווינה מוצגת תמונה 1 1,2. טרום התגבשות LCP-FRAP מבחני הם אופציונליים, אך הם יכולים להאיץ באופן משמעותי את התהליך של חיפוש אחר התנאים התגבשות ראשונית, במיוחד במקרה של חלבונים בממברנה קשה 3.
1. חלבון הכינון של LCP
- לטהר חלבון קרום עניין בתמיסת דטרגנט ולרכז את חלבון / אבקת מתחמי ל ~ 10-20 מ"ג / מ"ל, נזהרת שלא מעל לרכז את 1,4 חומר ניקוי.
- העברה ~ 25 מ"ג שומנים מארח LCP (בדרך כלל monoolein) או תערובת שומנים לתוך צינור פלסטיק 1.5 מ"ל ו לדגור על 40 מעלות צלזיוס למשך מספר דקות עד השומנים נמס.
- צרף מצמד המזרק מזרק 100 גז חזק μL.
- טען את המזרק עם השומנים המותכת בעזרת פיפטה נפח מתכווננת. הקלט את עוצמת הקול של השומנים בתוך המזרק.
- עוד טען מזרק 100 μL עם פתרון חלבון ביחס חלבון פתרון ל-השומנים 2 / 3 v / נ
- חבר את שני מזרקים יחד דרך מצמד את המזרק.
- Push המזרק בוכנות לחילופין להעביר את השומנים והחלבונים באמצעות מחט הפנימי של מצמד, הלוך וחזור, עד mesophase שומנים הופכת הומוגנית. LCP צורות באופן ספונטני על ערבוב מכני, הופך את החלבון מחדש ב bilayer השומנים של LCP. כינונה של LCP יכול להיות מאומת על ידי עקביות שקוף דמוי ג'ל שלה על ידי בהעדר birefringency כאשר מתחת למיקרוסקופ מצויד צולבות מקטבים, או, אם אפשר, באמצעות זווית קטנה רנטגן עקיפה 1.
2. LCP-FRAP טרום התגבשות מבחני
LCP-FRAP מבחני נועדו למדוד את התכונות דיפוזיה של חלבונים בממברנה מחדש ב LCP במגוון של תנאי ההקרנה 3. דיפוזיה לטווח ארוך של חלבונים בממברנה של LCP חיונית התגבשות מוצלח, עם זאת, מיקרו של LCP מגביל דיפוזיה של חלבונים גדולים או אגרגטים חלבון oligomeric. סיבה נפוצה לכישלון של הניסוי התגבשות טווינה היא צבירת חלבון מהיר שמוביל לאובדן של דיפוזיה. הוכח כי התנהגות צבירה של חלבון תלוי לבניית חלבון מסוים, שומנים מארח את ההרכב של פתרון ההקרנה 3.
- לייבל את החלבון עם פלורסנט לצבוע (Cy3 או דומה) ביחס חלבון / צבע של ~ 100 / 1, להסיר את צבען unreacted ולרכז את החלבון ל ~ 1 מ"ג / מ"ל. תווית או אמינים חינם או thiols חינם. כאשר תיוג אמינים ללא תשלום, לשימוש pH בין 7 ל 7.5 ברובה התווית בחינם N-הסופית. שים לב תיוג אמינו יכול גם תווית שומנים שיתוף מטוהרים עם חלבון 2,3.
- לשחזר את החלבון שכותרתו LCP כמתואר בסעיף 1).
- הגדרת לוחות assay, כמתואר בסעיף 3) באמצעות LCP-FRAP פתרונות ההקרנה במקום מסכי התגבשות 2.
- דגירה צלחות ב 20 ° C בחושך במשך לפחות 12 שעות כדי להשיג מצב שיווי משקל.
- מקום אחד הלוחות בתחנת LCP-FRAP ולהתמקד הראשון גם באמצעות המטרה 10x.
- רוכשת 5 תמונות ניאון כדי ללכוד את המצב ההתחלתי מראש מולבן.
- טריגר הלייזר. כוח לייזר מספר פולסים צריך להיות מותאם אקונומיקה ~ 30 - 70% של חלבון הנקרא באמצע במקום מולבן.
- מיד לאחר מפעילה לייזר, להתחיל להקליט רצף מהיר שלאחר הלבנה של ~ 200 תמונות בקצב המהיר ביותר.
- פעל עם הקלטה של רצף שלאחר אקונומיקה איטי של ~ 50 תמונות, בחירת עיכוב בין תמונות כמו 1-20 s, תלוי בקצב הדיפוזיה של החלבון.
- שלב את העוצמה בפנים במקום אקונומיקה במסגרות כל ולתקן אותה הלבנה ואור תנודות בעוצמה במהלך הרכישה על ידי חלוקת העוצמה בתוך המקום מולבן מעוצמת ממוצע של נקודה התייחסות מחוץ לאזור לייזר מולבן.
- נרמל את עוצמת לתקן כדי להפוך את עוצמת מראש מולבן שווה 1 ואת עוצמת מולבן הראשונית שווה 0.
- התאם את העיקול של עוצמת זמן מנורמל לעומת, F (t), באמצעות המשוואה הבאה: 5
F (t) = M x exp (-2T / t) x (אני 0 (2T / t) + אני 1 (2T / t)), (Eq.1)
שם M היא חלק ניידים של מולקולות לשדר, T הוא הזמן דיפוזיה אופייני, לא זה הזמן האמיתי של כל מסגרת מוקלט, אני 0 ואני 1 הם ה 0 ו 1 כדי רחוב שונה פונקציות בסל. - חשב את מקדם הדיפוזיה, D, כמו:
D = R 2 / 4T, (Eq.2)
כאשר R הוא רדיוס במקום מולבן. - העבר לאo היטב הבא וחזור על שלבים 2.5) - 2.13).
- השוואת שברים ניידים מקדמי דיפוזיה שהושגו על תנאי ההקרנה שונים. התגבשות עיצוב חדש המסכים המבוססים על רכיבים שאפשרו דיפוזיה חלבון ותנאי למעט עבורו דיפוזיה חלבון לא נצפתה. אם החלבון לא מפוזר בכל התנאים הוקרנו, שקול להרחיב את שטח הקרנה או מנסה חלבון חדש לבנות.
3. הגדרת ניסויים התגבשות LCP
- החלבון מחדש ב LCP כמתואר בסעיף 1).
- מעבירים את LCP חלבון עמוס לתוך מזרק 10 גז חזק μL מצורף מזרק מנפק חוזרות.
- צרף מחט נשלף קצר (מד 26, 10 מ"מ אורך) כדי המזרק μL 10.
- לוותר על 200 פיתיונות מיובשים NL של LCP על פני השטח של ארבע בארות סמוכות ויוצרים ריבוע 2x2.
- כיסוי כל אחד פיתיונות מיובשים LCP עם μL 1 של התגבשות הפתרון המתאים למסך.
- שווי ארבע בארות עמוסה coverslip זכוכית 18 מ"מ מרובע. החלת לחץ עדין על coverslip לאטום את הבארות.
- חזור על שלבים 3.4) -3.6) עם סט הבא של 4 הבארות עד צלחת כולו מלא.
- דגירה את הצלחת בטמפרטורה קבועה, מעת לעת בדיקה ליצירת צמיחה קריסטל.
4. מסיק מן קריסטלים LCP
- מניחים צלחת עם גבישי חלבון תחת מיקרוסקופ סטריאופוני עם זום משתנה, מצויד מקטב מנתח מסתובב ליניארי.
- התמקד גם ריבית באמצעות זום צריכת חשמל נמוכה, כך גם כל מושם בתוך שדה הראייה.
- ציון הזכוכית coverslip בתוך ארבע משיכות עושה ריבוע בתוך גבולות גם באמצעות אבן הפינה החדה של חיתוך קרמיקה נימי.
- לחץ מסביב הבקיע עם פינצטה חדה נקודה חזקה כדי להפיץ את שריטות באמצעות עובי הזכוכית coverslip.
- פאנץ שני חורים קטנים בפינות מול הכיכר הבקיע.
- הזרק μL כמה פתרון נמהר דרך אחד החורים להפחית התייבשות במהלך השלבים הבאים.
- באמצעות בדיקה זווית מחט חדה לשבור את הכוס לאורך אחד או שני הצדדים לשחרר את הכיכר לחתוך החוצה.
- הרם בזהירות את צופה מרובע זכוכית בולוס השלב מעוקב. אם בולוס הוא דבק coverslip, ואז להפוך את הכיכר זכוכית מעל ומניחים על תחתית הבאר.
- הוסף μL מספר נוסף של פתרון נמהר, בתוספת cryo-מגנים, במידת הצורך, על גבי בולוס חשפו את השלב מעוקב בבאר.
- הגדל את ההגדלה של המיקרוסקופ ולהתמקד גביש.
- התאם את הזווית בין מקטב לבין מנתח להגדיל את הניגוד בין הגביש birefringent ואת הרקע, תוך שמירה על מספיק אור כדי לראות את הלולאה קציר.
- בחר MicroMount MiTeGen בקוטר התאמת גודל קריסטל ואז מסיק קריסטל ישירות LCP על ידי וגרף אותו לתוך MicroMount.
- פלאש להקפיא את MicroMount עם הגביש שנקטפו בחנקן נוזלי, ולשלוח אותו beamline מקור synchrotron עבור רנטגן איסוף הנתונים 6.
5. נציג תוצאות:
בטא מהונדסים אדם 2 adrenergic G-חלבון קולטן מצמידים (β 2 AR-T4L) באה לידי ביטוי baculovirus sf9 נגועים בתאי חרקים מטוהרים ב dodecylmaltoside (DDM) / cholesteryl hemisuccinate (CHS) פתרון אבקת חייב אגוניסט הפוך חלקי carazolol 7. חלבון היה תווית עם אסתר NHS Cy3 בשימוש LCP-FRAP טרום התגבשות מבחני (איור 2). מסכי רשת גס מבוסס על כמה תנאים שנבחרו מתוצאות LCP-FRAP מבחני הפיק הראשוני קריסטל דמוי להיטים (איור 3). אופטימיזציה נוספת של התנאים נמהר הניבו איכות עקיפה גבישים (איור 4).
באיור 1. תרשים זרימה של ניסוי LCP טיפוסי התגבשות. צעדים בתיבות אפור לא מתוארים בפרוטוקולים הנוכחי.
2. איור LCP-FRAP assay עם AR-T4L/carazolol 2 β ב LCP monoolein מבוסס. א) תוצאות של assay LCP-FRAP ביצע במצב תפוקה גבוהה אוטומטית, שבה כל דגימה של צלחת 96-גם הוא מחומצן ברצף והתאוששות הקרינה נמדדת לאחר דגירה 30 דקות. החלמה הקרינה שהתקבלו, המייצגים את השבר הנייד מדגם זה, הם זממו במשך כל 96 דגימות. פתרונות סינון מכילים 0.1 M טריס pH 8, 30% v / v PEG 400 בשילוב עם 48 מלחים שונים בשני ריכוזים שונים. ב) התאוששות פרופילים Fluorescence עבור נציג מספרresentative תנאים. עקומות קו מוצק מייצגים מתאים על ידי Eq. שברים ניידים 1.The ואת מקדמי דיפוזיה נקבעים באמצעות Eqs. 1 ו -2. התאוששות מהירה של פחות מ -10% במדגם המכיל כלוריד Na נובע שומנים שכותרתו fluorescently שיתוף מטוהרים עם החלבון.
איור 3. להיטים קריסטל ראשוניות של AR-T4L/carazolol 2 β מתקבל על ידי מיון רשת גס סביב התנאים המבטיחים ביותר שזוהה על ידי LCP-FRAP, המכיל סולפט Na (פאנל) ו Na Formate (לוח ב '). חלבון הוא תווית עם אסתר NHS Cy3 ותמונות פלורסנט נלקחים באמצעות עירור ב 543 ננומטר פליטה ב 605 ננומטר.
איור 4. גבישים אופטימליים של AR-T4L/carazolol 2 β. התמונות של גבישים גדל בנוכחות סולפט Na (לוחות A ו-B) ו-K Formate (פאנלים C ו-D) נלקח במצב brightfield (לוחות A ו-C) ושימוש צולבות מקטבים (לוחות B ו-D).
Discussion
פרוטוקולים לספק הדרכה Visual Basic עבור שלבים עיקריים מעורבים בביצוע ניסויים טווינה התגבשות. מעמיק יותר פרטים הקשורים הפרוטוקולים הללו, תוך הדגשת החסרונות אפשרי, חסרונות או מסלולים חלופיים זמינים במקומות אחרים 1,2. אופציונלי LCP-FRAP מבחני יכול לעזור בשלבים מוקדם כדי לבחור את מבנה החלבון המבטיחים ביותר, שומנים LCP מארח ותוספים שומנים בדם, כמו גם להגביל את טווח מזרזים אפשרי ותנאי חיץ 3. לאחר ללהיט התגבשות ראשונית נמצא, הוא צריך להיות מותאם כדי להשיג גבישים באיכות טובה יותר. אופטימיזציה של בתנאים טווינה התגבשות דומה בעיקרו אופטימיזציה התנאים חלבונים מסיסים בתוספת פרמטרים נוספים הקשורים בהרכב LCP 1. חלבון ממברנה גבישים הגדלים mesophase lipidic הם בדרך כלל קטנים יותר מאשר לקבל גבישים בתמיסה חומרי ניקוי, אך הורה יותר, ובכך, הנאה מאוד מלהשתמש microfocus beamlines זמין המודרנית מקורות synchrotron 6.
רבים מן הנהלים הקשורים ב התגבשות טווינה, כולל הגדרת לוחות התגבשות או assay, ניהול LCP-FRAP מבחני ואת גילוי גבישים, כבר למחצה או אוטומטי לחלוטין 1,2,8,9, המאפשר הקרנת מגוון גדול של תנאים בעוד לצרוך כמויות קטנות של חלבון ושומן. מצד שני, reconstitutions חלבון LCP והקציר קריסטל להישאר פעולות ידניות ומייגע יותר, ולכן יש צורך בשיפור.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה בחלקים ידי מענקים NIH GM073197 ו RR025336.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μL gas-tight syringe | Hamilton Co | 7656-01 | 2 syringes are required |
| 10 μL gas-tight syringe | Hamilton Co | 7653-01 | |
| Syringe coupler | Hamilton Co | 7770-02 30902 | The coupler can be made using available parts as described in refs. 10 |
| Repetitive syringe dispenser | Hamilton Co | 83700 | The repetitive syringe dispenser can be modified to reduce dispensing volume by ~3 times11 |
| Short (0.375”) flat-tipped removable needle (point style 3, gauge 26) | Hamilton Co | 7804-03 | |
| 96-well glass sandwich plate | Marienfeld | 08 900 03 | For manual operations it is more convenient to assemble the glass sandwich plate using a standard microscope glass slides and a double sticky tape with punched holes1,2,12. |
| Glass cover slip | Electron Microscopy Sciences | 63787-01 | |
| monoolein | Sigma-Aldrich | M7765 | |
| Crystallization screens | Hampton Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience | Most of available commercial screens can be used for initial screening. Conditions that consistently disrupt LCP can be diluted 2x for better compatibility13. | |
| Capillary cutting stone | Hampton Research | HR4-334 | |
| Fine point tweezers | Ted Pella, Inc. | 510 | |
| Angled sharp probe | Ted Pella, Inc. | 13650 | |
| MicroMounts | MiTeGen | M1-Lxx-xx | Select MicroMount diameter to match the crystal size |
References
- Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).
- Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets. Methods Mol. Biol. 654, 141-170 (2010).
- Cherezov, V., Liu, J., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Stevens, R. C. LCP-FRAP assay for pre-screening membrane proteins for in meso crystallization. J. Cryst. Growth Design. 8, 4307-4315 (2008).
- Misquitta, Y., Caffrey, M. Detergents destabilize the cubic phase of monoolein: implications for membrane protein crystallization. Biophys. J. 79, 394-405 (2003).
- Soumpasis, D. M. Theoretical analysis of fluorescence photobleaching recovery experiments. Biophys. J. 41, 95-97 (1983).
- Cherezov, V., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Hilgart, M. C., Sanishvili, R., Nagarajan, V., Stepanov, S., Fischetti, R. F., Kuhn, P., Stevens, R. C. Rastering strategy for screening and centering of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 micrometer size X-ray synchrotron beam. J. R. Soc. Interface. 6, S587-S597 (2009).
- Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Stevens, R. C. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
- Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases. Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).
- Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases. Anal. Chem. 82, 491-497 (2010).
- Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).
- Cherezov, V., Caffrey, M. A simple and inexpensive nanoliter-volume dispenser for highly viscous materials used in membrane protein crystallization. J. Appl. Cryst. 38, 398-400 (2005).
- Cherezov, V., Caffrey, M. Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins. J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).
- Cherezov, V., Fersi, H., Caffrey, M. Crystallization screens: compatibility with the lipidic cubic phase for in meso crystallization of membrane proteins. Biophys J. 81, 225-242 (2001).
