Summary
فحوصات لقياس وظائف السلوك الحركي والتعلم والذاكرة والقدرات في
Abstract
وقد مكنت التطورات في أساليب الوراثية في دراسة الجينات المسؤولة عن أمراض الاعصاب الإنسان باستخدام ذبابة الفاكهة كنظام نموذج 1. وتتميز معظم هذه الأمراض ، بما في ذلك مرض الزهايمر ، وباركنسون ومرض هنتنغتون حسب العمر التي تعتمد على تدهور في وظائف التعلم والذاكرة وتنسيق الحركة 2. هنا نستخدم المقايسات السلوكية ، بما في ذلك فحص انجذاب بالجاذبية السلبية (3) ومقايسة مكره قمع phototaxic (APS مقايسة) 4،5 ، لإظهار أنه يمكن تلخيصها بعض خصائص السلوك المرتبطة تنكس عصبي الإنسان في الذباب. في مقايسة انجذاب بالجاذبية السلبية ، الميل الطبيعي للذباب للتحرك ضد الجاذبية عندما يتم استخدامها لدراسة الجينات تحريكها أو الظروف التي قد تعوق قدرات الحركي. في مقايسة وكالة الأنباء الجزائرية ، ويتم اختبار وظائف التعلم والذاكرة في ضوئية ، إيجابي الذباب تدريب المنتسبين إلى الضوء مع طعم مرارة مكره ، وبالتالي تجنب هذا الميل الطبيعي إلا للتحرك في اتجاه الضوء. اختبار هذه المدربين الذباب يستخدم 6 ساعات ما بعد التدريب لتقييم وظائف الذاكرة. باستخدام هذه المقايسات ، يمكن لمساهمة أي عوامل وراثية أو بيئية نحو تنكس عصبي النامية درس بسهولة في الذباب.
Protocol
1. مقدمة
في هذا الفيديو ، وسوف نظهر two المقايسات السلوكية باستخدام ذبابة الفاكهة للتدليل على قياس للتنقل وظائف التعلم والذاكرة التي هي في خطر الاضطرابات العصبية. أولا ، سوف نظهر كيف يمكن قياس السلوك الحركي باستخدام مقايسة انجذاب بالجاذبية سلبية. الثانية ، سنقوم بتقييم قدرات التعلم والذاكرة باستخدام الذباب موجب ضوئية أن يتم تدريب المنتسبين إلى الضوء مع الطعم المر مكره واختبارها ثم 6 ساعات في وقت لاحق لتقييم وظائف الذاكرة. أخيرا ، وسوف نناقش الآثار والقيود المفروضة على هذه المقايسات السلوك.
2. المعدات والكواشف
- يطير العمل
- ستيريو النطاق (زايس)
- مدببة صغيرة لدفع الذباب
- ذبابة الفاكهة ثاني أكسيد الكربون (CO 2) جهاز تخدير (Geneseesci ، المؤتمر الوطني العراقي)
- انجذاب بالجاذبية الفحص سلبية
- 28.5 X 95 مم البوليستيرين فيال (الكابيتول فيال ، وشركة)
- مصغرة انذار الموقت / ساعة توقيت (VWR الدولية)
- أقلام Sharpie
- لاصق
- مكره الفحص قمع انجذاب ضوئي
- هيدروكلوريد الكينين (سيغما الدريتش ؛ CAS رقم : 6119-47-7)
- الماء المقطر
- مقياس رقمي قياس دقيق للتخفيف من وزنها
- افصل سريعة موصلات ، البولي اثيلين عالي الكثافة (NALGENE VWR كتالوج رقم 62868-021)
- 15 مل أنبوب الطرد المركزي (VWR الدولية) ، وقطع في علامة مل 2 من نهاية مغلقة لتتناسب مع محول سريعة رابط افصل لمصدر الضوء
- 200 قناة واحدة لتحميل pipetter ميكرولتر حل الكينين على الورق مرشح بطانة الغرفة
- T - المتاهة (نظم سلوكية بسيطة ؛ الشكل 1)
- احباط الألومنيوم
- ضوء المصدر (زايس)
- مصباح مع الضوء الأحمر.
- مرشح ورقة
- مصغرة انذار الموقت / ساعة توقيت (VWR الدولية)
3. اعداد الذباب
- تمسك الذباب على وسط الذرة ، دبس ، أجار الخميرة القياسي عند 25 درجة مئوية في دورة الضوء / الظلام 12 ساعة.
- معزولون الذباب عذراء تحت التخدير ثاني أكسيد الكربون في يوم eclosion. للدراسات الشيخوخة ، ويتم الاحتفاظ الذباب في مجموعات من عشرين في قارورة ونقلها الى قنينة جديدة كل 3 أيام. من المهم استخدام الذباب الأشقاء من نفس الوالدين عبور للدراسات الشيخوخة ، للتقليل من الخلافات الناشئة عن خلفيات وراثية.
- لفحوصات على حد سواء ، وبالغت الذباب والحفاظ في مجموعات من عشرة الذباب في القارورة. الفرق بين الجنسين في السلوك كبيرة ويستحسن ألا نخلط الذباب الذكور والإناث في الدراسة عن بيانات قد يكون من الصعب تفسير وإعادة 6.
- لمقايسة انجذاب بالجاذبية السلبية ، يتم فرزها في مجموعات من الذباب عشرة في قارورة واختبار ساعة واحدة بعد التخدير. فمن المهم للذباب لاسترداد تماما من التخدير لأن ذلك قد يكون لها تأثير على الأنشطة الحركي.
- لفحص وكالة الأنباء الجزائرية ، وتوضع كل مجموعة من الذباب في قنينة فارغة بالماء البوليسترين مبلل رقة الترشيح لمدة ست ساعات قبل أن يتم إجراء الفحص. هذا يضمن أن يتم تجويع الذباب قبل الفحص ، وسوف تكون أكثر الادراك لتذوق مكره. فقط قبل إجراء الفحص ، يتم وضع كل يطير من مجموعة من عشرة في أنبوب الطرد المركزي 15mL فارغة ، ثم توج التي هي فضفاضة ، لتجنب هروب.
4. انجذاب بالجاذبية الفحص سلبية
- ويقاس عادة للانجذاب بالجاذبية 10-20 مجموعات من عشرة أفراد من نفس النمط الجيني أو المعاملة (100-200 الذباب الإجمالية لكل الوراثي / العلاج) 7. فرز مجموعات من عشرة الذباب الإناث أو الذكور على جهاز تخدير ثاني (2) ووضع كل فريق في قارورة منفصلة. تسمح على الأقل ساعة واحدة للذباب للتعافي من التخدير.
- إعداد جهاز تسلق لكل مجموعة ، بحيث يتم ربط عموديا two البوليسترين قارورة فارغة الشريط يواجه كل منهما الآخر. فمن المهم للتأكد من أن يتم محاذاة تماما فتحات قوارير مع بعضها البعض لتوفير تسلق السطح حتى الذباب.
- لأقل فيال ، قياس المسافة العمودية من 8 سم فوق سطح القاع وعلامة كل قارورة عن طريق رسم دائرة حول محيط كامل من القارورة.
- نقل مجموعة من عشرة الذباب في أسفل القارورة بعناية منع هروب أي يطير. تغطية مباشرة لانخفاض فيال فيال مع أعلى والشريط آمن بالقرب من فتحات الاتصال. السماح للذباب للتأقلم على الوضع الجديد لمدة 1 دقيقة قبل إجراء الفحص.
- اضغط برفق الذباب وصولا الى الجزء السفلي من القارورة وقياس عدد من الذباب الذي يمكن أن ترتفع فوق حاجز 8 سم في 10 ثانية بعد الصنبور.
- كرر هذا الاختبار لنفس المجموعة عشر مرات ، والسماح لمدة 1 دقيقة فترة راحة بين كل محاكمة.
- تسجيل عدد من الذباب في المجموعة التي تجاوزت 8 سم ، بوصفهاالنسبة المئوية من مجموع الذباب.
5. مكره الفحص قمع انجذاب ضوئي (APS الفحص)
تكييف أصلا من بور لو وBuecher (2002) 4 ، وهذا الفحص يستغل ضوئية السلوك الإيجابي في الذباب لتدريبهم لربط الضوء مع المثيرات مكره (في هذه الحالة ، الطعم المر من الكينين). بعد مرحلة التدريب / التكييف ، وسوف يطير النوع البري تكون قادرة على ربط منطقة مضاءة مع الذوق مكره وتجنب ذلك. وسوف يطير مع قدرات التعلم خطر الفشل لجعل هذه الجمعيات. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا للمقايسة وكالة الأنباء الجزائرية أن تستخدم لقياس وظيفة الذاكرة على المدى القصير من الذباب 5 بإخضاع الذباب بالفعل تدريبهم على نفس الاختبار 6 ساعات تكييف آخر لاختبار قدرتهم على التذكر في المهمة المستفادة.
- إعداد محلول الكينين
- هيدروكلوريد الكينين تذوب في الماء المقطر لجعل حل الأسهم 0.1M (1.98g 50mL في الماء المقطر). يمكن أن تظل الحل السهم عند -20 درجة مئوية لمدة تصل الى عام في aliquots الصغيرة
- يعد حل يعملون من 1 ميكرومتر تمييع الحل من خلال الأسهم في الماء المقطر.
- إعداد T - المتاهة
- T - متاهة تتكون من مركز العمود مع فخ الباب واثنين من غرف مستقلة ، و "الظلام" وغرفة "مضاء" غرفة (الشكل 1).
- غرفة التحضير : يستغرق عامين 15mL الأنابيب البلاستيكية وقطع أجهزة الطرد المركزي في 2 مل علامة من أسفل نهاية مغلقة مع دليل المنشار. تناسب محولات موصل في كل نهاية ، وختم الاتصال مع parafilm. محول في نهاية الأنبوب بمثابة فتحة إدخال معقوفة لمصدر الضوء. توصيل أنبوب واحد مع مصدر الضوء ، وهذا الأنبوب سيكون "مضاء" غرفة. التفاف الأنبوب الآخر برقائق الألومنيوم لتكون بمثابة غرفة "مظلمة".
- إضافة 180uL إما من الماء المقطر أو محلول الكينين لتصفية ورقة وضعها في غرفة الخفيفة.
- تجميع T - المتاهة التي الشد الغرف مضاءة والظلام على كل جانب من العمود الوسط ، مع الباب المغلق في فخ الوسط (الشكل 1).
- إدراج مصدر الضوء في غرفة مضاءة.
- التدريب الذباب لقمع انجذاب ضوئي مع المثيرات مكره
- فك غرفة مظلمة من المتاهة - T ونقل ذبابة واحدة في هذه القاعة والمسمار على الفور الأنبوب المظلم مرة أخرى إلى المتاهة.
- إطفاء الأنوار في الغرفة وتشغيل المصباح الأحمر.
- السماح للسفر إلى التأقلم في غرفة مظلمة لمدة 30 ثانية ، وتتحول شيئا فشيئا على مصدر للضوء تنير الغرفة مضاءة. فتح الباب ببطء الفخ الذي يفصل بين الغرفتين.
- إذا كان يمشي يطير إلى غرفة مضاءة في غضون 10 ثانية ، ويعتبر إيجابيا ضوئية ، وهي على استعداد لتدريبهم للمقايسة. الفشل في انجذاب ضوئي يشير مشاكل في النظام البصري والذباب مع انجذاب ضوئي سلبية يجب أن يتم استبعادها من مقايسة.
- لانجذاب ضوئي مكره التدريب (APS) قمع ، انقر فوق الذبابة التي أظهرت إيجابية انجذاب ضوئي إلى حجرة مظلمة ، أغلق الباب وفخ أطفئي الضوء. سماح 30 ثانية من التأقلم. خلال هذا الوقت وضعت ورقة فلتر مع حل الكينين في غرفة مضاءة. فتح الباب ببطء اعتراض وتشغيل ضوء. السماح للطيران المشي الى غرفة مضاءة المغلفة الكينين. بعد دقيقة واحدة ، اضغط على الطيران مرة أخرى إلى غرفة مظلمة وكرر ذلك مرات أكثر 9. (عادة ، اكتب البرية الذباب تجنب الغرفة مضاءة بعد محاكمات التدريب 3-5).
- مباشرة بعد التدريب ، سيتم إجراء اختبار التجارب الخمس. في كل محاكمة اختبار ، وتمكين 10 ثانية بعد تشغيل الضوء على الطيران لتدريبهم على المشي إلى غرفة مضاءة. سيتم تسجيل الفشل في السير إلى القارورة مضاءة ب "تمرير" ، وهو ما يعادل "المهمة المستفادة من خلال تعزيز". وسجلت نسبة النجاح أكثر من خمس تجارب متتالية والمبينة أدناه في الشكل (2) ، PC0 (0 تكييف آخر ساعة).
- تقييم قصير الأجل وظيفة الذاكرة في الذباب
- وبعد التدريب الأولي التسجيلات PC0 ، يتم وضع كل يعود إلى قارورة من الأغذية الأصلية وأبقى جانبا لمدة ست ساعات.
- ستة تدريب آخر ساعة ، وتخضع كل يطير إلى 5 المحاكمات مرة أخرى بنفس الطريقة كما في السابق ، وتسجيل عدد المرات التي تطير يتجنب (تمرير) أو يذهب الى (فشل) القارورة مضاءة. وسجلت نسبة النجاح في هذا PC6 (6 تكييف آخر ساعة) ، وهو مؤشر على الذاكرة على المدى القصير.
6. تفسير البيانات والتحليل الإحصائي
- انجذاب بالجاذبية الفحص سلبية
- البيانات الخام الناتجة عن هذا الاختبار يمثل عدد من الذباب عبور حاجز 8 سم في 10 ثانية في كل مجموعة. تحويل هذا إلى النسبة المئوية وحساب متوسط نسبة النجاح لكل مجموعة على مدى 10 جلسة.
- يتم تمثيل البيانات بيانيا كمعدل متوسط تمرير مجموعة (النمط الجيني ، والعلاج وما إلى ذلك) مع الخطأ المعياري للمتوسط (SEM).
- الفروق بين الجماعاتومن ثم يمكن تحديدها لتكون ذات دلالة إحصائية أو عدم استخدام الطلاب T - اختبار أو ANOVA.
- مكره الفحص قمع انجذاب ضوئي
- يتم تمثيل البيانات الخام من هذا الاختبار وعدد المرات التي تطير يتجنب كل غرفة مضاءة في خمس محاكمات متتالية. ويتم احتساب معدل النجاح كنسبة مئوية من التجارب الناجحة على تجنب المحاكمات الإجمالي. حساب متوسط نسبة النجاح في هذه الطريقة لمدة لا تقل عن 15 الذباب في المجموعة.
- ويمثل بيانيا البيانات ومعدل النجاح المتوسط PC0 (مباشرة بعد تكييف ؛ "التعلم" المؤشر) أو متوسط نسبة النجاح PC6 (6 تكييف آخر ساعة ، "الذاكرة" مؤشر) مع SEM منها.
- تتم مقارنة مؤشرات التعلم والذاكرة بين الجماعات مع كل نوع البرية و "التلاعب وراثيا ، حميدة" مجموعة (مثل الذباب overexpressing GFP) بشكل مناسب.
7. ممثل النتائج
في هذه التجربة الفيديو ، ونحن بصدد تقييم التعلم والذاكرة والعجز في المحرك تاو overexpressing الذباب الإنسان في النظام العصبي المركزي ومقارنة أدائهم لتلك الذباب overexpressing GFP. وقد تبين من overexpression العصبية تاو الإنسان في ذبابة الفاكهة يسبب تشكل الفجوات الحادة في الدماغ يؤدي الى 8 و عجز كبير في التعلم وظائف الذاكرة 9. كما هو مبين في الشكل 2A ، ذكر العمر 10 يوما أو أنثى الذباب overexpressing الإنسان تاو تعاني من عجز كبير مقارنة الحركي العمر المتطابقة overexpressing GFP الذباب. بالإضافة إلى ذلك ، فشل هذه الذباب لربط الضوء مع الطعم المر كما يتضح من معدل النجاح PC0 بالمقارنة مع مجموعة المراقبة ، فضلا عن فشل كما أن نتذكر هذا الارتباط كما هو مبين في انخفاض نسبة النجاح PC6 (الشكل 2B). كذلك بالتحقق من صحة هذه التجربة التي يمكن أن تستخدم نماذج ذبابة الفاكهة لدراسة الظروف الاعصاب الإنسان وتلخص بعض الظواهر السلوكية لوحظ في البشر والثدييات.
الشكل 1. T - المتاهة الإعداد لقمع انجذاب ضوئي الفحص مكره ألف. الإعداد العام التجريبية للتجربة APSA مع مصدر الضوء متصلا "مضاء" أنبوب الصقر ، واصطف مع ورقة تصفية و "الظلام" على اليسار أنبوب (المشمولة في احباط) ، مفصولة فخ الباب. باء وخلال مرحلة التدريب والاختبار ، ويطير في غرفة مظلمة وفتحت الباب المصيدة بعد تشغيل الضوء على في غرفة مضاءة.
الشكل 2. نتائج ممثلة من انجذاب بالجاذبية السلبية والتجربة الجزائرية باستخدام الذباب overexpressing GFP أو تاو مع سائق عموم العصبية ألف. في مقايسة انجذاب بالجاذبية السلبية ، و 10 يوما من العمر من الذكور (العمود الأزرق) أو أنثى (عمود أحمر) الذباب overexpressing GFP أظهرت ارتفاع النشاط تسلق تاو - overexpressing من الذباب. ب 20 يوما القديمة الذباب الإناث overexpressing GFP أظهرت أفضل التعلم (PC0) والذاكرة (PC6) وظائف من تاو overexpressing الذباب.
Discussion
انجذاب بالجاذبية سواء السلبية والمقايسات وكالة الأنباء الجزائرية والمقايسات سلوكية قوية لقياس التغيرات في الحركي أو التعلم وقدرات الذاكرة الناجمة عن التلاعب وراثية أو بيئية. ومع ذلك ، هناك بعض السلبيات لهذه المقايسات التي تنتظر التحسين أخرى.
في مقايسة انجذاب بالجاذبية السلبية ، يمكن أن طفرات في جينات معينة تجعل اختلالات حادة في المحرك الذباب. في مثل هذه الحالات ، يمكن للذباب تسلق الجدران بالكاد ردا على خطورة التحريض عليها. قد المقايسات السلوك الأخرى التي تقيس مباشرة الحركة تكون أكثر ملاءمة. وتشمل هذه المقايسات السلوك المنعكس المقوم أن التدابير الشلل ومصادرة 10 ، والسلوك الذي يسجل 11 optomotor فقدان التنسيق الحركة.
في مقايسة وكالة الأنباء الجزائرية ، يمكن أن يكون أول عائق وقف الذباب بشكل عشوائي عند مدخل غرفة مضاءة دون المضي قدما. هذا يصبح أكثر من مسألة إذا الشيخوخة هو أحد الشروط التي تمت دراستها ، منذ أقدم الذباب هي أقل نشاطا في العام ، وتميل إلى التوقف والراحة لفترات طويلة من الزمن. في هذه الحالة مجرب وتقديم محفزات لتشجيع الحركة الميكانيكية ، والتي ليست دائما فعالة. ثانيا ، يمكن للمرء أن يجادل بأن عدم الذهاب إلى غرفة مضاءة النتائج من فقدان انجذاب ضوئي إيجابية. هذا نادرا ما يحدث ، لأن العمل السابقة قد دلت على أن يطير إلى الوراء لضوء الاستجابة بمجرد إزالة السلبية تعزز 4. ثالثا ، قد مدة اتصال مع التحفيز مكره تختلف من المحاكمة إلى المحاكمة. عادة هذا الاختلاف يمكن أن يخفض بنسبة يطوق الجدار الداخلي للغرفة مع ورقة فلتر لمنع الذباب غارقة من تجنب الكينين. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للتأكد من أن كل مجرب يطير يقضون وقتا كافيا في اتصال مع ورقة الترشيح عن طريق زيادة مقدار الوقت الذي يقضيه في غرفة من 1 دقيقة لاحظت ذلك.
باختصار ، انجذاب بالجاذبية السلبية والمقايسات وكالة الأنباء الجزائرية طرق سريعة وبسيطة لتقييم العجز والسلوكية وتشير كميا والتعلم الحركي وقدرات الذاكرة في ذبابة الفاكهة. هذه القياسات ليست مفيدة بشكل خاص في نمذجة ظروف الاعصاب الإنسان في ذبابة الفاكهة.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور تشارلز Luetje لتوفير T - المتاهة وغرفة السلوك. ويؤيد هذا العمل من قبل جمعية القلب الاميركية (لYA) ، والمعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية R01NS64269 غرانت (لRGZ) ، وصندوق بيو الخيرية (لRGZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene Vial | Capitol Vial, Inc. | 28Fly | 28.5 x 95 mm Polystyrene Vial; material quality important, bad if too slippery for flies to climb. |
| Dissecting Stereoscope | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1432-979 | 2 branches goose-neck light guide (12V/30W) |
| Quinine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | 6119-47-7 | Dissolve in distilled water. |
| Quick Disconnect Connectors | Nalge Nunc international | 62868-021 | High-Density Polyethylene |
| T-Maze | Simple Behavioral Systems | ||
| Single-channel 200 μL pipette | Eppendorf | 022443305 |
References
- Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila. Annual Review of Neuroscience. 26, 627-656 (2003).
- Lloyd, T. E. &, Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 58, 1112-1119 (1967).
- Le Bourg, E., Buecher, C. Learned suppression of photopositive tendencies in Drosophila melanogaster. Animal Learning & Behavior. 30, 330-341 (2002).
- Seugnet, L., Suzuki, Y., Stidd, R., Shaw, P. J. Aversive phototaxic suppression: evaluation of a short-term memory assay in Drosophila melanogaster. Genes Brain Behav. 8, 377-389 (2009).
- Nilsen, S. P., Chan, Y. -B., Huber, R., Kravitz, E. A. Gender-selective patterns of aggressive behavior in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12342-12347 (2004).
- Leal, S. M., Neckameyer, W. S. Pharmacological evidence for GABAergic regulation of specific behaviors in Drosophila melanogaster. J Neurobiol. 50, 245-261 (2002).
- Wittmann, C. W., Wszolek, M. F., Shulman, J. M., Salvaterra, P. M., Lewis, J., Hutton, M., Feany, M. B. Tauopathy in Drosophila: Neurodegeneration Without Neurofibrillary Tangles. Science. 293, 711-714 (2001).
- Mershin, A., Pavlopoulos, E., Fitch, O., Braden, B. C., Nanopoulos, D. V., Skoulakis, E. M. Learning and memory deficits upon TAU accumulation in Drosophila mushroom body neurons. Learn Mem. 11, 277-287 (2004).
- Ganetzky, B., Wu, C. F. Indirect Suppression Involving Behavioral Mutants with Altered Nerve Excitability in DROSOPHILA MELANOGASTER. Genetics. 100, 597-614 (1982).
- Hall, J. C. Acetylcholinesterase mutants in Drosophila and their effects on the structure and function of the central nervous system. J Comp Neurol. 189, 741-774 (1980).
