Summary
測定運動機能、学習、およびメモリ能力のための行動アッセイ
Abstract
遺伝的手法の進歩は、モデルシステム1としてショウジョウバエを用いてヒト神経変性疾患に関与する遺伝子の研究が有効になっている。アルツハイマー病、パーキンソン病やハンチントン病を含むこれらの疾患のほとんどは、学習と記憶機能と運動協調2の年齢依存性劣化によって特徴付けられる。ここでは、人間の神経変性に関連した行動の特性のいくつかはハエでrecapitulatedできることを示すために、負の走地性の検定3と嫌悪phototaxic抑制アッセイ（APSアッセイ）4,5、を含む行動アッセイを、使用してください。動揺が運動能力を妨げる可能性の遺伝子または条件を調査するために利用される際に、負の走地性の検定では、ハエの自然な傾向は、重力に逆らって移動する。 APSのアッセイでは、学習と記憶の機能は、正に走でテストされている嫌悪苦味を有する光を関連付ける、従って光に向かって移動するには、このそうでない場合は自然な傾向を避けるために、訓練飛行。 6時間後のトレーニングはメモリ機能を評価するために使用されているこれらの訓練されたハエのテスト。これらのアッセイを用いて、神経変性を発展させるためのあらゆる遺伝的または環境的要因の寄与は、簡単にハエで検討することができます。
Protocol
1。はじめ
このビデオでは、我々は運動と神経変性疾患の危険にさらされている学習と記憶機能の測定を示すために、 ショウジョウバエを使って 2つの行動アッセイのデモンストレーションを行います。最初に、我々は、運動行動が負の走地性アッセイを用いて測定することができる方法を紹介します。第二に、我々は嫌悪苦味を有する光を関連付けるために訓練して、メモリ機能を評価するために6時間後に試験されている正走光ハエを使用して、学習と記憶能力を評価します。最後に、我々はこれらの行動アッセイの意義と限界について説明します。
2。機器と試薬
- 仕事を飛ぶ
- ステレオスコープ（ツァイス）
- ハエをプッシュするための小さなペイントブラシ
- ショウジョウバエ二酸化炭素（CO 2）麻酔器（Geneseesci、株式会社）
- 負の走地性アッセイ
- 28.5 × 95 mmのポリスチレンバイアル（キャピトルバイアル、（株））
- ミニアラームタイマー/ストップウォッチ（VWRインターナショナル）
- シャーピーペン
- 接着テープ
- 嫌悪走光性の抑制アッセイ
- 塩酸キニーネ（シグマアルドリッチ、CAS番号：6119-47-7）
- 蒸留水
- 重量で正確な希釈用デジタル測定尺度
- クイックディスコネクタ、高密度ポリエチレン（NALGENE VWR商品番号62868〜021）
- 光源用クイックディスコネクタアダプタと合わせて閉鎖端から2mLのマークでカット15 ml遠心チューブ（VWRインターナショナル）、
- チャンバーの内側を覆うフィルター紙の上にキニーネのソリューションをロードするために、シングルチャンネル200μLピペッター
- T -迷路（シンプルな行動システム、図1）
- アルミ箔
- 光源（ツァイス）
- 赤い光でランプ。
- ろ紙
- ミニアラームタイマー/ストップウォッチ（VWRインターナショナル）
3。ハエの準備
- ハエは25℃、標準コーンミール寒天、糖蜜、酵母の培地で12時間の明/暗サイクルでCに保持されます。
- 処女のハエが羽化の日の二酸化炭素麻酔下で絶縁されています。老化研究のために、ハエがバイアル当たり20のグループ内に保持され、3日ごとに新鮮なバイアルに移した。遺伝的背景に起因する違いを最小限に抑えるため、老化研究のために、同じ親のクロスから兄弟のハエを使用することが重要です。
- 両方のアッセイでは、ハエがバイアルあたり10個ハエのグループに性欲を刺激すると保持されます。行動に男女差は有意であり、データは6を解釈し、再現するのは難しいかもしれませんが、それは研究で、男性と女性のハエが混在しないことをお勧めします。
- 負の走地性アッセイのために、ハエがバイアルごとに10のグループにソートされ、麻酔後1時間をテストした。これは運動活動に影響を与える可能性があるのでハエが麻酔から完全に回復することが重要です。
- APSアッセイのために、各グループのハエは、アッセイを実行する前に6時間ろ紙を湿らせた水と空のポリスチレンバイアルに配置されます。これは、ハエがアッセイの前に飢えていると嫌悪味に、より鋭敏になることが保証されます。検定が実行される直前に、10のグループからそれぞれのフライは、エスケープを避けるために、ゆるく蓋をされ、空の15mlの遠心管に配置されます。
4。負の走地性アッセイ
- 走地性は一般に、同じ遺伝子型や治療の10人（各遺伝子型/治療のために合計100から200ハエ）7の十から二十グループに対して測定されます。 CO 2麻酔器と場所には10の女性または男性のハエのソートグループ別のバイアル内の各グループ。麻酔から回復するハエの少なくとも1つの時間を許可します。
- 二つの空ポリスチレンバイアルが垂直に対向してテープでつながっているように各グループのクライミング装置を、準備します。バイアルの開口部が完全にハエのためにも登山の表面を提供するために、互いに整列していることを確認することが重要です。
- 下のバイアルの場合は、底面上に8cmの垂直距離を測定し、バイアルの全周に円を描くことによって、各バイアルをマーク。
- 慎重にフライの脱出を防止する低バイアルに10ハエのグループを転送します。すぐにしっかりと接触する開口部の近くにバイアルおよびテープと下バイアルをカバー。ハエは、アッセイを行う前に1分間のための新しい設定に慣れることができます。
- ゆっくりとバイアルの底にハエをタップし、タップした後、10秒で、8 cmのマークの上に登ることができますハエの数を測定する。
- 各試行の間に1分間の休止期間を考慮し、同じグループに10回、このアッセイを繰り返します。
- として8 cmのマークを渡されたグループごとのハエの数を記録合計ハエの割合。
5。嫌悪走光性の抑制アッセイ（APSアッセイ）
もともとルブールとBuecher（2002）4から適応、このアッセイは、嫌悪刺激（この場合は、キニーネの苦味）の光を関連付けるためにそれらを訓練するためにハエの正の走光性行動を悪用します。トレーニング/コンディショニング段階の後、野生型のハエは、嫌悪の味と明るい領域を関連付けると、それを避けることができるようになります。侵害の学習能力を持つハエはこの関連付けを行うために失敗します。さらに、APSのアッセイはまた、学んだタスクを思い出すの能力をテストするために同じテストを6時間後のコンディショニングに既に訓練されたハエを施すことにより5を飛ぶの短期記憶機能を測定するために使用することができます。
- キニーネ溶液を調製
- 0.1Mストック溶液（50mLの蒸留水で1.98グラム）を作るために蒸留水で塩酸キニーネを溶かす。ストック溶液は小分けに年に-20℃までのために保持することができます
- 蒸留水でのストック溶液を希釈することにより、1μMのワーキング溶液を調製。
- T -迷路の準備
- T -迷路はトラップドアと2つの独立したチャンバー、"暗い"チャンバーと"点灯"チャンバー（図1）と中央の列で構成されています。
- チャンバーの準備には2つの15mlのプラスチック遠心管に取り、底から2 mLのマークで切断手動で終了して閉じていた。両端にコネクタアダプタを合わせ、パラフィルムで接続をシール。チューブの端のアダプタは、グースネックの光源の入力スロットとして機能します。光源とつのチューブを接続し、このチューブは"明るい"チャンバーになります。 "暗い"室として機能するようにアルミホイルを使用して他のチューブを巻きます。
- 蒸留水や光のチャンバー内で紙と場所をフィルタリングするためにキニーネのソリューションのいずれかの180uLを追加。
- 中央の閉鎖（図1）のトラップドアで、中央の列の両側に点灯し、暗いチャンバーをねじ込んでT -迷路を組み立てる。
- 照明室に光源を挿入します。
- 訓練は、嫌悪刺激と走光性を抑制するために飛ぶ
- T -迷路から緩めて暗室をし、このチャンバ内に単一のフライを転送し、すぐに迷路に戻って暗いチューブをねじ込みます。
- 部屋の照明をオフにし、赤のランプをオンにします。
- フライは、30秒間暗室に順応し、徐々に明るい部屋を照らす光源をオンにすることができます。徐々に二つの部屋を分けるトラップドアを開きます。
- フライは10秒以内に点灯室に歩いている場合、それは積極的に走光とみなされ、アッセイのために訓練される状態になります。走光性の障害は、アッセイから除外する必要がある負の走光性と視覚系とハエの問題があることを示します。
- 忌避走光性の抑制（APS）トレーニング、暗室に戻って向光性を示したフライをタップするために、トラップドアを閉じて、光をオフにする。 acclimatizingの30秒を許可する。この時間の間に照明室にキニーネ溶液をろ紙を置く。徐々にトラップドアを開いて、光をオンにします。キニーネコーティング点灯チャンバ内へのハエの散歩を許可します。 1分後、暗室に戻ってフライをタップし、これを9回以上繰り返す。 （通常、野生型は3〜5訓練の試験後に点灯チャンバーを避ける飛ぶ。）
- すぐにトレーニングの後、5つのテストの試験が実施される。各試験の試験では、光が照明室に歩いて訓練されたハエのためにオンになって10秒後に許可する。照明バイアルに歩いて失敗は、"強化を通じて学習タスク"に相当する、"パス"として記録されます。 5年連続の試行の合格率はPC0（0時間後のコンディショニング）として記録し、下の図2に示されています。
- ハエの短期記憶の機能を評価する
- 訓練と初期PC0録音した後、各フライは元の食品のバイアル瓶に戻し入れられ、6時間わき続けた。
- 六時間後研修、被験者の前と同じ方法で再び5試験にそれぞれのフライ、そして（失敗）フライは回避（合格）または入る明るいバイアルを回数を記録。この合格率は、短期記憶の指標であるPC6（6時間ポストコンディショニング）、として記録されます。
6。データの解釈と統計解析
- 負の走地性アッセイ
- このアッセイから生成された生データは、各グループに10秒で8センチの大台にハエの数を表します。割合にこれを変換し、10セッション以上の各群の平均合格率を計算する。
- データは平均値の標準誤差（SEM）を持つグループごとの平均合格率（遺伝子型、治療法など）としてグラフィカルに表現されます。
- 群間の差して、Student t検定またはANOVAを用いて統計的に有意かどうかであると決定することができます。
- 嫌悪走光性の抑制アッセイ
- このアッセイからの生データは、各フライは5つの連続試験では照明室を回避する回数として表されます。合格率は、合計回の試行の成功回避の試行の割合として計算されます。グループごとに15ハエの最小値は、この方法で平均合格率を計算する。
- または平均合格率PC6（6時間後のコンディショニング、"メモリ"インジケータ）、それぞれのSEMと、データがグラフィカルに平均合格率PC0（インジケータを"学ぶ"すぐにコンディショニング後）として表されます。
- 学習と記憶のインデックスは、野生型と"遺伝子操作 - 良性"グループ（GFP過剰発現が飛ぶような）適切に両方と群間で比較されています。
7。代表的な結果
このビデオの実験では、我々は中枢神経系でハエを過剰発現するヒトのタウの学習と記憶と運動障害を評価していますし、ハエを過剰発現するGFPのものに彼らのパフォーマンスを比較。 ショウジョウバエにヒトのタウの神経過剰発現は、脳8に深刻な空胞化を引き起こすと学習と記憶機能の9の大幅な赤字につながることが示されている。図2Aに示すように、10日齢の雄または雌のショウジョウバエを過剰発現するヒトのタウは、年齢をマッチさせたGFP過剰発現が飛ぶと比較して有意な運動の障害を持っている。さらに、これらのハエは、対照群に比べてPC0合格率によって示されるように苦味を有する光を関連付けるだけでなく、PC6合格率（図2B）の減少によって示されるように、この関連付けを覚えて失敗する失敗しました。この実験では、さらにショウジョウバエモデルは人間の神経変性状態を研究し、ヒトや哺乳動物で観察された行動の表現型の一部をrecapitulatingに使用できることを検証します。
図1。忌避走光性の抑制アッセイのためのT -迷路のセットアップ。A.トラップドアで区切られた濾紙と左側に"暗く"チューブ（箔で覆われた）と並ぶ"点灯"ファルコンチューブに接続されている光源とAPSAの実験のための総合的な実験、、。 B.トレーニングやテストのフェーズにおいて、フライは、暗室内にあり、光が明るい部屋でオンになって後にトラップドアが開きました。
図2。汎神経ドライバでハエを過剰発現するGFPまたはTauを使用して負の走地性とAPSの実験から代表的な結果。A.負の走地性の検定では、10日齢の雄（青列）またはメス（赤の列）を過剰発現するGFPは、タウ過剰発現が飛ぶよりも高い上昇活性を示した飛ぶ。 B. 20日齢の雌では過剰発現するGFPは、タウ過剰発現が飛ぶよりも、よりよい学習（PC0）とメモリ（PC6）の機能を示した飛ぶ。
Discussion
負の走地性とAPSアッセイの両方は、遺伝的または環境的操作に起因する運動や学習と記憶容量の変化を測定するための堅牢な行動アッセイです。しかし、さらなる最適化を待って、これらのアッセイにはいくつかの欠点があります。
負の走地性の検定では、特定の遺伝子の突然変異はハエで重度の運動機能障害をレンダリングすることができます。このようなケースでは、ハエはほとんど攪拌時に重力に反応して壁を登ることはできません。直接運動を測定する他の行動アッセイでは、より適切な場合があります。これらのアッセイは、麻痺と発作10を測定する立ち直り反射行動、および運動協調の損失を記録する微細運動行動11があります。
APSのアッセイでは、最初の障害は、ランダムに前方に移動することなく、照明室の入り口で停止ハエすることができます。古いハエが一般的にあまり積極的であり、長期間停止して休息する傾向があるので、高齢化が、研究条件のいずれかである場合、これは問題の多くになります。この場合、実験者は、常に効果的ではない動きを、促進するための機械的な刺激を提供しなければならない。第二に、一つは障害が正の走光性の損失からつけられたチャンバーの結果に移動すると主張するかもしれない。強化負が4を削除すると、以前の仕事はハエが光反応性に引き返すことが示されているので、これは、あまりないケースです。第三に、嫌悪刺激との接触の持続期間は、裁判から裁判に異なる場合があります。この変化は通常、キニーネを避けてからハエを防ぐために浸したろ紙を容器の内壁を取り囲むことによって減らすことができます。さらに、実験者は各フライは特に断りのない1分からチャンバーに費やされる時間の量を増やすことによって、ろ紙との接触に十分な時間を過ごすようにすることができます。
要約すると、負の走地性とAPSのアッセイは、行動障害を評価するための高速かつ簡単な方法であり、定量的に運動し、 ショウジョウバエにおける学習と記憶の能力を示している。これらのアッセイは、 ショウジョウバエにおける人間の神経変性条件をモデル化するのに特に有用である。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
著者らは、T -迷路と動作の部屋を提供するための博士チャールズLuetjeに感謝したいと思います。この作品は、米国心臓協会（YAへ）、神経疾患のための国立研究所と脳卒中グラントR01NS64269（RGZに）、とピュー慈善信託（RGZまで）によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene Vial | Capitol Vial, Inc. | 28Fly | 28.5 x 95 mm Polystyrene Vial; material quality important, bad if too slippery for flies to climb. |
| Dissecting Stereoscope | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1432-979 | 2 branches goose-neck light guide (12V/30W) |
| Quinine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | 6119-47-7 | Dissolve in distilled water. |
| Quick Disconnect Connectors | Nalge Nunc international | 62868-021 | High-Density Polyethylene |
| T-Maze | Simple Behavioral Systems | ||
| Single-channel 200 μL pipette | Eppendorf | 022443305 |
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