Summary
Gedrag assays voor het meten van motorische functies, leren en geheugen capaciteiten in
Abstract
Vooruitgang in de genetische methoden in staat hebben gesteld de studie van de genen die betrokken zijn in de menselijke neurodegeneratieve ziekten met behulp van Drosophila als model systeem 1. De meeste van deze ziekten, waaronder Alzheimer, Parkinson en de ziekte van Huntington worden gekenmerkt door leeftijdsafhankelijke achteruitgang van de leer-en geheugenfuncties en beweging de coördinatie 2. Hier gebruiken we gedrags-assays, inclusief de negatieve geotaxis test 3 en de aversieve phototaxic onderdrukking assay (APS-test) 4,5, om aan te tonen dat een deel van het gedrag kenmerken die geassocieerd worden met menselijke neurodegeneratie kan worden samengevat in vliegen. In het negatieve geotaxis assay, de natuurlijke neiging van vliegen te bewegen tegen de zwaartekracht als opgewonden wordt gebruikt om genen of omstandigheden die een belemmering kunnen vormen motorische capaciteiten te bestuderen. In de APS-test, zijn de leer-en geheugenfuncties getest positief phototactic vliegt opgeleid aan het licht associëren met aversieve bittere smaak en vandaar deze andere natuurlijke neiging te vermijden om te bewegen in de richting van het licht. Het testen van deze getrainde vliegt zes uur na de training wordt gebruikt om het geheugen functies te beoordelen. Met behulp van deze testen, kan de bijdrage van een genetische of omgevingsfactoren in de richting van het ontwikkelen van neurodegeneratie gemakkelijk bestudeerd worden in vliegen.
Protocol
1. Introductie
In deze video, zullen we laten twee gedrags-assays met behulp van Drosophila om de meting van de motoriek en leren en geheugen functies die in het gedrang in neurodegeneratieve aandoeningen aan te tonen. Eerst zullen we zien hoe locomotorisch gedrag kan worden gemeten met behulp van de negatieve geotaxis test. Ten tweede, zullen we leren en geheugen vaardigheden met behulp van positief phototactic vliegen die zijn opgeleid aan het licht associëren met een aversieve bittere smaak en vervolgens 6 uur later getest op geheugenfuncties te beoordelen. Ten slotte zullen we ingaan op de implicaties en beperkingen van deze assays gedrag.
2. Apparatuur en reagentia
- Fly werken
- Stereo bereik (Zeiss)
- Kleine penselen voor het duwen vliegen
- Drosophila kooldioxide (CO 2) verdoving apparaten (Geneseesci, Inc)
- Negatieve Geotaxis Assay
- 28,5 x 95 mm polystyreen Vial (Capitol Vial, Inc)
- Mini-Alarm Timer / Stopwatch (VWR International)
- Sharpie pennen
- Plakband
- Aversieve Phototaxis Onderdrukking Assay
- Kinine hydrochloride (Sigma Aldrich, CAS-nummer: 6119-47-7)
- Gedestilleerd water
- Digitale meetschaal voor een nauwkeurige verdunning van het gewicht
- Quick Disconnect Connectors, High-Density Polyethyleen (Nalgene VWR Catalog No 62868-021)
- 15 ml centrifugebuis (VWR International), knip op de 2 mL score gesloten einde te maken met de Quick Disconnect Connector adapter geschikt voor lichtbron
- Single-channel 200 pi pipetter te kinine oplossing te laden op filterpapier de binnenkant van de kamer
- T-Maze (Gewone Behavioral Systems; figuur 1)
- Aluminium folie
- Light Source (Zeiss)
- Een lamp met rood licht.
- Filtreerpapier
- Mini-Alarm Timer / Stopwatch (VWR International)
3. De voorbereiding van de Flies
- Vliegen worden bijgehouden op een standaard maïsmeel-agar-melasse-gist medium bij 25 ° C op een 12 uur licht / donker-cyclus.
- Virgin vliegen zijn geïsoleerd onder kooldioxide verdoving op de dag van Eclosion. Voor oudere studies, zijn vliegen gehandhaafd in groepen van twintig per flacon en overgebracht naar een vers flesje om de 3 dagen. Het is belangrijk om sibling vliegt gebruik van dezelfde ouders kruis voor oudere studies, om verschillen als gevolg van genetische achtergrond te minimaliseren.
- Voor zowel de testen, zijn vliegen gesekst en in stand gehouden in groepen van tien vliegen per flacon. Het geslacht verschil op het gedrag is aanzienlijk en is het raadzaam niet aan mannelijke en vrouwelijke vliegt mengen in een onderzoek, als gegevens kunnen worden moeilijk te interpreteren en te reproduceren 6.
- Bij negatieve geotaxis test, zijn vliegen gesorteerd in groepen van tien per flacon en getest een uur na de anesthesie. Het is belangrijk dat vliegt om volledig te herstellen van narcose, omdat dit mogelijk een effect op de motorische activiteiten.
- Voor APS-test, zijn vliegen van elke groep geplaatst in een lege polystyreen flesje met water bevochtigd filtreerpapier voor zes uur voor de test wordt uitgevoerd. Dit zorgt ervoor dat de vliegen worden uitgehongerd voordat de test en zullen meer opmerkzaam op aversieve smaak. Vlak voordat de test wordt uitgevoerd, wordt elke vlieg uit een groep van tien geplaatst in een lege 15ml centrifugebuis, die vervolgens losjes is afgedekt, om te ontsnappen te voorkomen.
4. Negatieve Geotaxis Assay
- Geotaxis is over het algemeen gemeten tien tot twintig groepen van tien personen van hetzelfde genotype of behandeling (100-200 vliegt totaal voor elk genotype / behandeling) 7. Soort groepen van tien vrouwelijke of mannelijke vliegt op een CO 2 anesthesie apparatuur en plaats elke groep in een aparte flacon. Laat minstens een uur voor de vliegen om te herstellen van anesthesie.
- Bereid de klimtoestellen voor elke groep, zodanig dat twee lege flacons polystyreen verticaal zijn verbonden door plakband tegenover elkaar. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de openingen van de flacons perfect op elkaar afgestemd om een nog beklimmen oppervlak voor de vliegen te bieden.
- Voor de lagere flacon, te meten een verticale afstand van 8 cm boven de bodem en markeer iedere flacon door het tekenen van een cirkel rond de gehele omtrek van de flacon.
- Overdracht van een groep van tien vliegt naar de lagere flacon zorgvuldig te voorkomen het ontsnappen van vliegen. Direct betrekking hebben op de onderste flacon met de top flacon en tape veilig contact op te nemen bij de openingen. Laat de vliegen naar de nieuwe instelling voor een minuut acclimatiseren voor het uitvoeren van de test.
- Tik voorzichtig de vliegen tot op de bodem van de flacon en meet het aantal vliegen dat kan boven de 8-cm merk door 10 seconden na het beklimmen van de kraan.
- Herhaal deze test voor dezelfde groep tien keer, waardoor gedurende 1 minuut rust periode tussen elke poging.
- Noteer het aantal vliegen per groep die de 8-cm markeren doorgegeven als eenpercentage van de totale vliegen.
5. Aversieve Phototaxis Suppression Assay (APS Assay)
Oorspronkelijk overgenomen van Le Bourg-en Buecher (2002) 4, deze test maakt gebruik van de positieve phototactic gedrag in vliegt om hen te trainen om licht te associëren met aversieve stimuli (in dit geval, bittere smaak van kinine). Na een training / conditioning fase zal wild type vliegt in staat zijn om de verlichte ruimte met aversieve smaak associëren en te vermijden. Vliegen met een verminderde leervermogen zal niet aan deze vereniging te maken. Bovendien is de APS-test kan ook worden gebruikt om korte termijn geheugen functie van de te meten vliegt vijf door het onderwerpen van al getraind vliegt naar dezelfde test 6 uur na conditioneren op hun vermogen te testen in het onthouden van de geleerde taak.
- De voorbereiding van de kinine-oplossing
- Los kinine hydrochloride in gedestilleerd water tot een 0,1 M stockoplossing (1.98g in 50 ml gedestilleerd water) te maken. De voorraad oplossing kan worden bewaard bij -20 ° C voor maximaal een jaar in kleine fracties
- Bereid een werkende oplossing van 1 uM door verdunning van de stockoplossing in gedestilleerd water.
- De voorbereiding van de T-Maze
- T-doolhof bestaat uit de middelste kolom met de val deur en twee onafhankelijke kamers, een "donkere" kamer en een "verlichte" kamer (Figuur 1).
- Kamer voorbereiding: neem twee 15ml plastic centrifugebuizen en snij op 2 ml-markering van de onderkant gesloten einde met een manuele zaag. Plaats de connector adapters aan elk uiteinde, en sluit de verbinding met parafilm. De adapter aan het eind van de buis dient als de input slot voor de zwanenhals lichtbron. Sluit een buis met de lichtbron en deze buis zal de "verlichte" kamer te zijn. Wikkel de andere buis met aluminium folie om te dienen als de "donkere" kamer.
- Voeg 180uL van een van beide gedestilleerd water of kinine-oplossing op papier en leg filter in het licht kamer.
- Monteer de T-doolhof door schroeven de verlichte en donkere kamers aan weerszijden van de middelste kolom, met de val deur in het midden gesloten (figuur 1).
- Plaats de lichtbron in de verlichte kamer.
- Training vliegt phototaxis onderdrukken met aversieve stimuli
- Schroef de donkere kamer van de T-doolhof en de overdracht van een enkele vlieg in deze kamer en onmiddellijk terug te schroeven de donkere buis naar het doolhof.
- Schakel de verlichting in de kamer en zet op de rode lamp.
- Laat de vlieg te acclimatiseren in de donkere kamer voor 30 seconden en langzaam zet de lichtbron verlicht de verlichte kamer. Open langzaam het luik dat de twee kamers van elkaar scheidt.
- Als de vlieg loopt naar de verlichte kamer binnen 10 seconden, wordt het beschouwd als een positieve phototactic en is klaar om te worden opgeleid voor de test. Fout in phototaxis geeft problemen in het visuele systeem en vliegt met negatieve phototaxis moeten worden uitgesloten van de test.
- Voor aversieve Phototaxis Suppression (APS) training, tikt u op de vlieg die positieve phototaxis aangetoond terug naar de donkere kamer, sluit de val deur en zet het licht. Laat 30 seconden acclimatiseren. Gedurende deze tijd gezet filtreerpapier met kinine oplossing in de verlichte kamer. Open langzaam het valluik en zet het licht aan. Laat de vlieg wandeling door de kinine gecoate verlichte kamer. Na een minuut terug tikt u op het vliegen naar de donkere kamer en herhaal dit negen keer. (Typisch, wild type vliegt voorkomen dat de verlichte kamer na 3 tot 5 trainingen proeven.)
- Onmiddellijk na de training, zullen vijf testen proeven worden uitgevoerd. In elke test trial, 10 seconden nadat het licht is ingeschakeld voor de getrainde vliegen om te lopen naar de verlichte kamer. Niet om te lopen naar de verlichte flacon wordt geregistreerd als "Pass", die gelijk is aan "taak geleerd door versterking". Het Pass-tarief over vijf opeenvolgende proeven is opgenomen en hieronder weergegeven in figuur 2 als pc0 (0 uur na conditionering).
- Het beoordelen van korte-termijn geheugen Functie in Flies
- Na de training en de eerste pc0 opnames, wordt elke vlieg terug geplaatst in zijn oorspronkelijke voedsel flacon en opzij gehouden voor zes uur.
- Zes uur na de training, onder voorbehoud van elk vliegen naar vijf proeven weer op dezelfde manier als voorheen, en noteer het aantal keren dat de vlieg voorkomt (pass) of gaat in (fail), de verlichte flacon. Dit slagingspercentage is opgenomen als PC6 (6 uur na conditionering), wat een indicator is van korte termijn geheugen.
6. Interpretatie van gegevens en statistische analyse
- Negatieve Geotaxis Assay
- De ruwe data gegenereerd uit deze test staat voor het aantal vliegen het oversteken van de 8-cm merk in 10 seconden in elke groep. Converteer dit percentage en berekenen het gemiddelde slagingspercentage voor elke groep meer dan 10 sessies.
- De gegevens worden grafisch weergegeven als een gemiddelde slagingspercentage per groep (genotype, behandeling enz.) met de standaardfout van de gemiddelde (SEM).
- Verschillen tussen groepenkan dan worden vastgesteld dat het statistisch significant of niet met behulp van een Student T-test of ANOVA.
- Aversieve Phototaxis Onderdrukking Assay
- De ruwe gegevens uit deze test wordt voorgesteld als het aantal keren dat elke vlieg vermijdt de verlichte kamer in vijf opeenvolgende studies. De pas wordt berekend als het percentage van succesvolle proeven te vermijden over de totale proeven. Bereken de gemiddelde slagingspercentage op deze manier voor een minimum van 15 vliegen per groep.
- De gegevens worden grafisch weergegeven als gemiddelde slagingspercentage pc0 (onmiddellijk na deze behandeling, "leren" indicator) of gemiddelde slagingspercentage PC6 (6 uur na conditionering; "geheugen"-indicator) met de respectievelijke SEM.
- Leren en het geheugen indices worden vergeleken tussen groepen met zowel wild-type en de "genetisch gemanipuleerde-goedaardige 'groep (zoals GFP tot overexpressie vliegen) gepast.
7. Representatieve resultaten
In deze video-experiment, zijn we het beoordelen van leren en het geheugen en de motorische stoornissen in vliegen overexpressie menselijke Tau in het centrale zenuwstelsel en het vergelijken van hun prestaties met die van vliegen tot overexpressie GFP. Neuronale overexpressie van de menselijke Tau in Drosophila is aangetoond dat ernstige vacuolisatie veroorzaken in de hersenen 8 en tot aanzienlijke tekorten in leer-en geheugenfuncties 9 leiden. Zoals getoond in Figuur 2A, 10 dagen oud man of vrouw vliegt overexpressie menselijke Tau hebben belangrijke motorische tekorten ten opzichte van leeftijd gematchte GFP tot overexpressie vliegen. Bovendien zijn deze vliegt het licht niet associëren met een bittere smaak, zoals blijkt uit pc0 slagingspercentage in vergelijking met de controlegroep, maar ook niet aan deze vereniging herinneren zoals aangetoond door een daling van PC6 slagingspercentage (Figuur 2B). Dit experiment bevestigt verder dat Drosophila modellen kunnen worden gebruikt voor de studie van de menselijke neurodegeneratieve aandoeningen en indient een aantal van de gedrags-fenotypes waargenomen bij mensen en zoogdieren.
Figuur 1. T-Maze-instellingen voor aversieve Phototaxis onderdrukken Assay. A. De algehele experimentele opstelling voor de APSA experiment met de lichtbron aangesloten op de "verlichte" falcon buis, bekleed met filtreerpapier en de "donkere" tube aan de linkerkant (in folie), gescheiden door een valluik. B. Tijdens de training en de testfase, de vlieg is in de donkere kamer en het luik geopend na het licht wordt ingeschakeld in de verlichte kamer.
Figuur 2. Representatieve resultaten van de negatieve geotaxis en APS experiment met behulp van GFP vliegt overexpressie of Tau met een pan-neuronale driver. A. In het negatieve geotaxis test, 10-dagen oude man (blauwe kolom) of vrouwelijk (rode kolom) vliegt overexpressie van GFP werden hogere klimmen activiteit dan Tau-overexpressie vliegen. B. 20-dagen oude vrouwtjes tot overexpressie GFP toonde beter leren (pc0) en geheugen (PC6) functies dan Tau tot overexpressie vliegen.
Discussion
Zowel de negatieve geotaxis en APS-assays zijn robuust gedrag assays op veranderingen in bewegingsapparaat of leren en geheugen capaciteiten als gevolg van genetische manipulatie of het milieu te meten. Er zijn echter een aantal nadelen aan deze assays dat verdere optimalisatie af te wachten.
In negatieve geotaxis assay, kunnen mutaties in bepaalde genen maken ernstige motorische disfuncties in vliegen. In dergelijke gevallen kan de vliegen nauwelijks beklimmen van de muren in reactie op de zwaartekracht op agitatie. Ander gedrag testen die direct te meten beweging wellicht meer geschikt. Deze testen omvatten oprichtreflex reflex gedrag dat verlamming en inbeslagname 10 en 11 optomotor gedrag dat het verlies van bewegingscoördinatie records maatregelen.
In APS-test, kan de eerste belemmering te zijn vliegt willekeurig stoppen bij de ingang van de verlichte kamer zonder te bewegen naar voren. Dit wordt meer van een probleem als de vergrijzing is een van de onderzochte de voorwaarden, omdat oudere vliegen minder actief zijn in het algemeen en hebben de neiging om te stoppen en rust voor lange tijd. In dit geval is de experimentator moet mechanische stimuli te verstrekken aan beweging, dat is niet altijd effectief te bevorderen. Ten tweede, zou men kunnen stellen dat het niet om naar de verlichte kamer het gevolg is van een gebrek aan positief phototaxis. Dit is zelden het geval, aangezien eerder werk heeft aangetoond dat vliegt terug te keren naar het licht responsiviteit als de negatieve te versterken wordt verwijderd 4. Ten derde, kan de duur van het contact met de aversieve stimulus variëren van onderzoek tot onderzoek. Deze variatie kan meestal worden verminderd door rond de binnenwand van de kamer met gedrenkt filtreerpapier om vliegen te voorkomen dat het vermijden van de kinine. Daarnaast kan de onderzoeker ervoor zorgen dat iedere vliegen genoeg tijd in contact met de filtreerpapier te brengen door het verhogen van de hoeveelheid tijd doorgebracht in de kamer van de anders vermeld 1 minuut.
Kortom, een negatieve geotaxis en APS-assays zijn een snelle en eenvoudige manieren van het beoordelen van afwijkend gedrag en kwantitatief aangeven bewegingsapparaat en leren en geheugen vaardigheden in Drosophila. Deze testen zijn vooral nuttig in het modelleren van de menselijke neurodegeneratieve omstandigheden in Drosophila.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen dr. Charles Luetje bedanken voor het verstrekken van de T-doolhof en het gedrag kamer. Dit werk wordt ondersteund door de American Heart Association (tot YA), het Nationaal Instituut voor Neurologische stoornis en Stroke Grant R01NS64269 (tot RGZ), en de Pew Charitable Trust (tot RGZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene Vial | Capitol Vial, Inc. | 28Fly | 28.5 x 95 mm Polystyrene Vial; material quality important, bad if too slippery for flies to climb. |
| Dissecting Stereoscope | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1432-979 | 2 branches goose-neck light guide (12V/30W) |
| Quinine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | 6119-47-7 | Dissolve in distilled water. |
| Quick Disconnect Connectors | Nalge Nunc international | 62868-021 | High-Density Polyethylene |
| T-Maze | Simple Behavioral Systems | ||
| Single-channel 200 μL pipette | Eppendorf | 022443305 |
References
- Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila. Annual Review of Neuroscience. 26, 627-656 (2003).
- Lloyd, T. E. &, Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 58, 1112-1119 (1967).
- Le Bourg, E., Buecher, C. Learned suppression of photopositive tendencies in Drosophila melanogaster. Animal Learning & Behavior. 30, 330-341 (2002).
- Seugnet, L., Suzuki, Y., Stidd, R., Shaw, P. J. Aversive phototaxic suppression: evaluation of a short-term memory assay in Drosophila melanogaster. Genes Brain Behav. 8, 377-389 (2009).
- Nilsen, S. P., Chan, Y. -B., Huber, R., Kravitz, E. A. Gender-selective patterns of aggressive behavior in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12342-12347 (2004).
- Leal, S. M., Neckameyer, W. S. Pharmacological evidence for GABAergic regulation of specific behaviors in Drosophila melanogaster. J Neurobiol. 50, 245-261 (2002).
- Wittmann, C. W., Wszolek, M. F., Shulman, J. M., Salvaterra, P. M., Lewis, J., Hutton, M., Feany, M. B. Tauopathy in Drosophila: Neurodegeneration Without Neurofibrillary Tangles. Science. 293, 711-714 (2001).
- Mershin, A., Pavlopoulos, E., Fitch, O., Braden, B. C., Nanopoulos, D. V., Skoulakis, E. M. Learning and memory deficits upon TAU accumulation in Drosophila mushroom body neurons. Learn Mem. 11, 277-287 (2004).
- Ganetzky, B., Wu, C. F. Indirect Suppression Involving Behavioral Mutants with Altered Nerve Excitability in DROSOPHILA MELANOGASTER. Genetics. 100, 597-614 (1982).
- Hall, J. C. Acetylcholinesterase mutants in Drosophila and their effects on the structure and function of the central nervous system. J Comp Neurol. 189, 741-774 (1980).
