Summary
Los ensayos para medir el comportamiento de las funciones del aparato locomotor, el aprendizaje y las habilidades de memoria en
Abstract
Los avances en los métodos genéticos han permitido el estudio de genes implicados en enfermedades neurodegenerativas humanas utilizando Drosophila como sistema modelo 1. La mayoría de estas enfermedades, incluyendo el Alzheimer, el Parkinson y la enfermedad de Huntington se caracteriza por depender de la edad deterioro en las funciones de aprendizaje y la memoria y la coordinación del movimiento 2. Aquí usamos los ensayos de comportamiento, incluyendo el ensayo geotaxis negativo 3 y el ensayo de supresión phototaxic aversivo (APS ensayo) 4,5, para demostrar que algunas de las características de comportamiento asociados a la neurodegeneración humano puede ser recapitulado en las moscas. En el ensayo de geotaxis negativo, la tendencia natural de las moscas para moverse contra la gravedad cuando se agita se utiliza para estudiar los genes o las condiciones que pueden dificultar la capacidad del aparato locomotor. En el ensayo de APS, las funciones de aprendizaje y la memoria se prueban en forma positiva-fototácticas moscas entrenados para asociar la luz con el sabor desagradable amargo y así evitar esta tendencia por lo demás natural a moverse hacia la luz. Prueba de estas moscas entrenados 6 horas después de la capacitación se utiliza para evaluar las funciones de memoria. El uso de estos ensayos, la contribución de factores genéticos o ambientales hacia el desarrollo de la neurodegeneración puede ser fácilmente estudiado en moscas.
Protocol
1. Introducción
En este vídeo, se muestran dos ensayos de comportamiento con Drosophila para demostrar la medición de la locomoción y las funciones de aprendizaje y la memoria que están comprometidos en las enfermedades neurodegenerativas. En primer lugar, vamos a mostrar cómo el comportamiento del aparato locomotor se puede medir mediante el ensayo de geotaxis negativo. En segundo lugar, vamos a evaluar las capacidades de aprendizaje y la memoria con moscas positivamente fototácticas que son entrenados para asociar la luz con un sabor desagradable amargo y ponerlas a prueba 6 horas más tarde para evaluar las funciones de memoria. Por último, se discutirán las implicaciones y limitaciones de estos ensayos de comportamiento.
2. Equipos y Reactivos
- Mosca de trabajo
- Alcance estéreo (Zeiss)
- Pinceles de pintura para empujar las moscas
- Drosophila de dióxido de carbono (CO 2) aparatos de anestesia (Geneseesci, Inc)
- Ensayo geotaxis negativo
- 28,5 x 95 mm de poliestireno Vial (Vial del Capitolio, Inc.)
- Mini-alarma del temporizador / cronómetro (VWR International)
- Sharpie plumas
- Cinta adhesiva
- Aversivo Phototaxis ensayo de supresión
- Clorhidrato de quinina (Sigma Aldrich, Número CAS: 6119-47-7)
- Agua destilada
- Balanza digital de medición precisos para la dilución en peso
- Conectores de desconexión rápida, Polietileno de Alta Densidad (Nalgene VWR Catalog No. 62868-021)
- 15 ml tubo de centrífuga (VWR International), corte en la marca de 2 ml de extremo cerrado para encajar con el adaptador de conector de desconexión rápida para la fuente de luz
- De un solo canal 200 pipeteador l para cargar la solución de quinina en papel de filtro de la cámara de revestimiento
- T-Maze (Simple sistemas de comportamiento; Figura 1)
- Papel de aluminio
- Fuente de luz (Zeiss)
- Una lámpara con luz roja.
- El filtro de papel
- Mini-alarma del temporizador / cronómetro (VWR International)
3. Preparación de las Moscas
- Las moscas se mantienen en el nivel de harina de maíz-agar-melaza-levadura medio a 25 ° C en 12 horas de luz / oscuridad ciclo.
- Moscas de la Virgen se encuentran aisladas bajo anestesia de dióxido de carbono en el día de la eclosión. Para los estudios de envejecimiento, las moscas se mantienen en grupos de veinte por vial y se transfiere a un vial de nuevo cada 3 días. Es importante la utilización de moscas hermanos de la misma cruz de los padres para estudios de envejecimiento, para minimizar las diferencias derivadas de las bases genéticas.
- Tanto para los ensayos, las moscas son sexuados y mantenidos en grupos de diez moscas por vial. La diferencia de género en el comportamiento es importante y es aconsejable no mezclar las moscas macho y hembra en un estudio que los datos pueden ser difíciles de interpretar y reproducir 6.
- Para el ensayo geotaxis negativo, las moscas se clasifican en grupos de diez por vial y probado una hora después de la anestesia. Es importante para que las moscas se recuperan completamente de la anestesia ya que esto podría tener un efecto sobre las actividades del aparato locomotor.
- Para el ensayo de APS, las moscas de cada grupo se coloca en un frasco de poliestireno vacío con agua papel de filtro humedecido durante seis horas antes del ensayo se lleva a cabo. Esto asegura que las moscas son muertos de hambre antes de la prueba y será más perceptiva al gusto desagradable. Justo antes del ensayo se realiza, cada mosca de un grupo de diez se coloca en un tubo de centrífuga de 15 ml vacío, que es el máximo libremente, para evitar el escape.
4. Ensayo geotaxis negativo
- Geotaxis se mide generalmente de diez a veinte grupos de diez individuos del mismo genotipo o el tratamiento (100-200 moscas total de cada genotipo / tratamiento) 7. Grupos de clase de diez moscas hembra o macho en un aparato de anestesia de CO 2 y el lugar de cada grupo en un vial separado. Deje por lo menos una hora de las moscas para recuperarse de la anestesia.
- Preparar el aparato de escalada para cada grupo, de tal manera que dos frascos de poliestireno vacío verticalmente unidas por cinta uno frente al otro. Es importante asegurarse de que las aberturas de los viales están perfectamente alineados entre sí para proporcionar una superficie plana de escalada para las moscas.
- Para el vial inferior, medir una distancia vertical de 8 cm por encima de la superficie del fondo y marcar cada vial dibujando un círculo alrededor de la circunferencia completa del vial.
- La transferencia de un grupo de diez moscas en el vial inferior con cuidado evitando el escape de cualquier mosca. Cubrir inmediatamente el vial inferior con el vial superior y la cinta de seguridad cerca de las aberturas de contacto. Permitir a las moscas para aclimatarse a la nueva configuración de 1 minuto antes de realizar el ensayo.
- Golpee suavemente las moscas a la parte inferior del vial y medir el número de moscas que se puede subir por encima de la marca de 8 cm por 10 segundos después de la llave.
- Repita esta prueba para el mismo grupo diez veces, lo que permite un período de minuto de descanso entre cada prueba.
- Anote el número de moscas por grupo que superó la marca de 8 cm comoporcentaje de moscas total.
5. Aversivo Phototaxis ensayo de supresión (APS Ensayo)
Originalmente adaptado de Le Bourg y Buecher (2002) 4, este ensayo explota el comportamiento positivo en fototácticas vuela a entrenarlos para asociar la luz con el estímulo aversivo (en este caso, el sabor amargo de la quinina). Después de una fase de entrenamiento / acondicionado, moscas de tipo salvaje será capaz de asociar la zona iluminada con un gusto desagradable y evitarla. Moscas con la capacidad de aprendizaje comprometida a dejar de hacer esta asociación. Además, el ensayo de APS también se puede utilizar para medir la función de memoria a corto plazo de las moscas de 5 sometiendo ya vuela entrenados para la misma prueba 6 horas después de acondicionamiento para poner a prueba su capacidad para recordar la tarea de aprender.
- Preparación de la solución de quinina
- Disolver el clorhidrato de quinina en agua destilada para hacer una solución madre 0,1 M (1.98g en 50 ml de agua destilada). La solución madre se mantuvo a -20 ° C durante un máximo de un año en pequeñas alícuotas
- Prepare una solución de trabajo de 1 M por dilución de la solución madre en agua destilada.
- Preparación de la T-Maze
- T-laberinto formado por la columna central con la puerta de la trampa y dos cámaras independientes, una cámara de "oscuro" y un "iluminado" de la cámara (Figura 1).
- Preparación de la cámara: tomar dos tubos de 15 ml de centrífuga de plástico y corte en la marca de 2 ml de la parte inferior cerrada final con una sierra manual. Ajustar los adaptadores en cada extremo, y sellar la conexión con parafilm. El adaptador en el extremo del tubo sirve como la ranura de entrada para la fuente de luz de cuello de cisne. Conecte un tubo con la fuente de luz y de este tubo será el "iluminado" de la cámara. Envuelva el otro tubo con papel de aluminio para servir como el "oscuro" de la cámara.
- Añadir 180uL ya sea de agua destilada o una solución de quinina para filtro de papel y lugar en la cámara de luz.
- Monte el laberinto en T atornillando las cámaras iluminadas y oscuras a cada lado de la columna central, con la puerta de la trampa en el medio cerrado (Figura 1).
- Inserte la fuente de luz en la cámara encendida.
- Formación vuela a suprimir fototaxis con estímulos aversivos
- Desenrosque la cámara oscura de la T-laberinto y la transferencia de una sola mosca en esta cámara y de inmediato el tornillo del tubo oscuro de nuevo al laberinto.
- Apague las luces en la habitación y enciende la luz roja.
- Permitir la marcha de aclimatación en la cámara oscura durante 30 segundos y poco a poco de encender la fuente de luz que ilumina la cámara encendida. Abra lentamente la puerta de la trampa que separa las dos cámaras.
- Si la mosca camina hacia la cámara encendida durante 10 segundos, se considera positiva fototácticas y está listo para ser entrenados para el ensayo. El fracaso en fototaxis indica problemas en el sistema visual y las moscas con fototaxis negativas deben ser excluidos de la prueba.
- Para aversivo supresión Phototaxis (APS) formación, toque la marcha que demostró fototaxis positivo de nuevo a la cámara oscura, cerca de la puerta de la trampa y apagar la luz. Espere 30 segundos de aclimatación. Durante este tiempo, poner un papel de filtro con una solución de quinina en la cámara encendida. Abra lentamente la puerta de la trampa y encender la luz. Deje que el caminar volar a la quinina recubierto cámara encendida. Después de un minuto, toque en el vuelo de regreso a la cámara oscura y repita este 9 veces más. (Por lo general, de tipo salvaje moscas evitar la cámara iluminada de 3 a 5 ensayos de entrenamiento.)
- Inmediatamente después del entrenamiento, cinco ensayos de prueba se llevará a cabo. En cada ensayo, test, esperar 10 segundos después de que la luz se enciende durante la marcha entrenados para caminar con la cámara encendida. La falta de pie de la iluminación vial será registrado como "Aprobado", lo que equivale a "tarea aprendida a través del refuerzo". La tasa de aprobación de más de cinco ensayos consecutivos, se registra y se muestra en la Figura 2 como PC0 (0 acondicionamiento post hr).
- Evaluar a corto plazo de la función de memoria en las moscas
- Después de la formación inicial y grabaciones PC0, cada mosca se coloca de nuevo en su frasco de alimento original y se mantuvo a un lado durante seis horas.
- Seis horas después del entrenamiento, cada sujeto volar a cinco ensayos de nuevo en la misma forma que antes, y registrar el número de veces que la mosca evita (pasa) o entra en (no) el vial iluminada. Esta tasa de aprobación se registra como PC6 (6 acondicionamiento post hrs), el cual es un indicador de la memoria a corto plazo.
6. Interpretación de datos y análisis estadístico
- Ensayo geotaxis negativo
- La información bruta obtenida a partir de este ensayo representa el número de moscas cruzar la marca de 8 cm en 10 segundos en cada grupo. Convertir esto en porcentaje y se calcula la tasa de aprobación promedio para cada grupo de más de 10 sesiones.
- Los datos se representan gráficamente como una tasa de aprobación promedio por grupo (genotipo, tratamiento, etc) con el error estándar de la media (SEM).
- Diferencias entre los gruposentonces se puede determinar que son estadísticamente significativas o no con un t de Student o ANOVA.
- Aversivo Phototaxis ensayo de supresión
- Los datos en bruto de este ensayo es representada como el número de veces que cada mosca evita la cámara encendida en cinco ensayos sucesivos. La tasa de aprobación se calcula como el porcentaje de ensayos para evitar el éxito en los ensayos total. Calcular la tasa de aprobación promedio de esta manera durante un mínimo de 15 moscas por grupo.
- Los datos se representa gráficamente como tasa de aprobación promedio PC0 (inmediatamente después del acondicionamiento, el "aprendizaje" indicador) o tasa de aprobación promedio de PC6 (6 horas después del acondicionamiento, la "memoria" indicador) con sus respectivos SEM.
- Los índices de aprendizaje y la memoria se comparó entre los grupos con tanto de tipo salvaje y "genéticamente manipulados-benigno" del grupo (por ejemplo, la sobreexpresión de GFP moscas) de manera apropiada.
7. Resultados representante
En este experimento de vídeo, estamos evaluando los déficits de aprendizaje y la memoria y el motor en las moscas que sobreexpresan humanos Tau en el sistema nervioso central y comparar sus resultados con los de las moscas que sobreexpresan GFP. Sobreexpresión del Tau neuronal humano en Drosophila se ha demostrado que causa vacuolización severa en el cerebro 8 y conducir a importantes déficits en el aprendizaje y las funciones de memoria 9. Como se muestra en la Figura 2A, 10 días de sexo masculino o femenino moscas que sobreexpresan humanos Tau tienen importantes déficits locomotores en comparación con la misma edad que sobreexpresan GFP moscas. Además, estas moscas no asociar la luz con un sabor amargo, como se muestra por tasa de aprobación PC0 en comparación con el grupo de control, así como dejar de recordar esta asociación, como se muestra por una disminución en la tasa de aprobación PC6 (Figura 2B). Este experimento sirve para validar que los modelos de Drosophila puede ser utilizado para el estudio de enfermedades neurodegenerativas humanas y la recapitulación de algunos de los fenotipos de comportamiento observados en los seres humanos y mamíferos.
Figura 1. T-laberinto de instalación de ensayo de supresión Phototaxis aversivo. A. La configuración general experimental para el experimento de APSA con la fuente de luz conectado a la "iluminada" tubo Falcon, forrado con papel de filtro y el tubo de "oscuro" de la izquierda (cubierto en papel de aluminio), separadas por una puerta trampa. B. Durante la fase de formación y las pruebas, la mosca en la cámara oscura y la puerta trampa se abrió después de que la luz se enciende en la cámara encendida.
Figura 2. Los resultados representativos de la geotaxis negativos y experimentar APS con moscas que sobreexpresan GFP o Tau con un controlador de pan-neuronal. A. En el ensayo de geotaxis negativos, 10 días de edad de sexo masculino (columna azul) o mujer (columna roja) las moscas que sobreexpresan GFP mostró una mayor actividad de la escalada de Tau con sobreexpresión de las moscas. B. 20 días de edad, las moscas hembra que sobreexpresan GFP mostró un mejor aprendizaje (PC0) y la memoria (PC6) las funciones de Tau sobreexpresión moscas.
Discussion
Ambos geotaxis negativos y los ensayos de APS son sólidas pruebas de comportamiento para medir los cambios en el aparato locomotor o el aprendizaje y la capacidad de memoria que surgen de la manipulación genética o el medio ambiente. Sin embargo, hay algunas desventajas para estos ensayos que esperan una mayor optimización.
En el ensayo de geotaxis negativo, las mutaciones en ciertos genes pueden hacer que las disfunciones graves de motor en las moscas. En tales casos, las moscas no pueden subir las paredes, en respuesta a la gravedad en la agitación. Otros ensayos que miden directamente el comportamiento de movimiento puede ser más apropiado. Estos ensayos incluyen el comportamiento de los reflejos que las medidas de la parálisis y convulsiones 10, y el comportamiento optomotor 11 que registra la pérdida de la coordinación del movimiento.
En el ensayo de APS, el primer obstáculo puede ser moscas al azar con parada en la entrada de la cámara encendida sin avanzar. Esto se convierte en un problema si el envejecimiento es una de las condiciones estudiadas, ya que las moscas mayores son menos activos en general, y tienden a detenerse y descansar durante largos períodos de tiempo. En este caso, el investigador tiene que proporcionar los estímulos mecánicos para promover el movimiento, que no siempre es eficaz. En segundo lugar, se podría argumentar que el hecho de ir a los resultados de la cámara iluminada de una pérdida de fototaxis positivo. Esto es raramente el caso, ya que el trabajo previo ha demostrado que las moscas de volver a la sensibilidad de la luz una vez que el negativo se elimina reforzar 4. En tercer lugar, la duración del contacto con el estímulo aversivo puede variar de un ensayo a otro. Esta variación normalmente se puede reducir rodea la pared interior de la cámara con papel de filtro empapado de evitar que las moscas evitando la quinina. Además, el experimentador puede asegurar que cada vuelo pasan suficiente tiempo en contacto con el papel de filtro por el aumento de la cantidad de tiempo empleado en la cámara de lo contrario 1 minuto.
En resumen, geotaxis negativos y los ensayos de APS son una forma rápida y sencilla de evaluar los déficit de comportamiento y cuantitativamente indican locomotor y capacidades de aprendizaje y memoria en Drosophila. Estos ensayos son particularmente útiles en la modelización de enfermedades neurodegenerativas humanas en Drosophila.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer al Dr. Charles Luetje para la prestación del T-laberinto y la sala de conducta. Este trabajo es apoyado por la American Heart Association (para YA), el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares subvención R01NS64269 (a RGZ) y el Pew Charitable Trust (a RGZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene Vial | Capitol Vial, Inc. | 28Fly | 28.5 x 95 mm Polystyrene Vial; material quality important, bad if too slippery for flies to climb. |
| Dissecting Stereoscope | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1432-979 | 2 branches goose-neck light guide (12V/30W) |
| Quinine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | 6119-47-7 | Dissolve in distilled water. |
| Quick Disconnect Connectors | Nalge Nunc international | 62868-021 | High-Density Polyethylene |
| T-Maze | Simple Behavioral Systems | ||
| Single-channel 200 μL pipette | Eppendorf | 022443305 |
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