Come nicchie e le cellule staminali si formano durante lo sviluppo è una questione importante con implicazioni pratiche. Nel<em> Drosophila</emOvaio>, germe di cellule staminali e la loro linea di nicchie somatiche formano durante lo sviluppo larvale. Questo video mostra come sezionare, macchia e montare gonadi femminili dalla fine del III instar (LL3)<em> Drosophila</em> Larve.
Molti organi dipendono da cellule staminali per il loro sviluppo durante l'embriogenesi e per la manutenzione o la riparazione durante la vita adulta. Capire come le cellule staminali forma, e come interagiscono con l'ambiente è quindi cruciale per la comprensione dello sviluppo, l'omeostasi e malattia. Dell'ovaio del moscerino della frutta Drosophila melanogaster ha servito come modello influente per l'interazione delle cellule staminali della linea germinale (GSCs) con le loro cellule somatiche di supporto (di nicchia) 1, 2. La posizione nota della nicchia e la GSCs, unita alla capacità di manipolare geneticamente, ha permesso ai ricercatori di chiarire una serie di interazioni tra cellule staminali e le loro nicchie 3-12.
Nonostante la ricchezza di informazioni sui meccanismi che controllano la manutenzione GSC e differenziazione, relativamente poco si sa su come GSCs e le loro nicchie di somatico forma durante lo sviluppo. Circa 18 nicchie somatiche, il cui cellulare componenti includono filamento terminale e cellule tappo (Figura 1), si formano durante la terza larvale instar 13-17. GSCs originano dalle cellule germinali primordiali (PGC). PGC proliferano in primi stadi larvali, ma in seguito alla formazione della nicchia un sottogruppo di PGC diventa GSCs 7, 16, 18, 19. Insieme, le cellule somatiche di nicchia e la GSCs fare una unità funzionale che produce uova per tutta la vita dell'organismo.
Molte domande riguardanti la formazione del gruppo GSC rimangono senza risposta. Processi quali il coordinamento tra le cellule precursore per nicchie e precursori di cellule staminali, o la generazione di asimmetria all'interno PGC man mano che diventano GSCs, può essere meglio studiato nella larva. Tuttavia, uno studio metodico di sviluppo dell'ovaio larvale è fisicamente impegnativo. In primo luogo, le ovaie sono piccole larve. Anche al fine di stadi larvali sono solo 100μm di diametro. Inoltre, le ovaie sono trasparenti e sono integrati in un corpo grasso bianco. Qui si descrive passo per passo il protocollo per isolare ovaie da fine del III instar (LL3) larve di Drosophila, seguita dalla colorazione con anticorpi fluorescenti. Vi offriamo alcune soluzioni tecniche a problemi quali localizzare le ovaie, colorazione e lavaggio dei tessuti che non affondare, e fare in modo che gli anticorpi penetrano nel tessuto. Questo protocollo può essere applicato a stadi precedenti larvali e di testicoli larvale pure.
Questo video dimostra un isolamento e il protocollo di colorazione della fine del III instar ovaie larvale. Per eseguire questo protocollo di routine e in modo affidabile, l'attenzione dovrebbe essere prestata ai seguenti punti:
The authors have nothing to disclose.
IM è supportato dal Marie Curie di reintegrazione di sovvenzione. Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo non Scienza Israele Grant. 1146-1108, da Helen e Martin Kimmel Istituto per la ricerca sulle cellule staminali presso il Weizmann Institute of Science e la Fondazione Leir beneficenza.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
NaCl | J.T.Baker | |||
Kcl | Merck | |||
CaCl2 | Sigma-Aldrich | |||
MgCl2 | Merck | |||
Sucrose | J.T.Baker | |||
Hepes | Sigma-Aldrich | |||
PBS | Sigma-Aldrich | |||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | |||
Albumin Bovine Fraction V | MP Biomedicals | 160069 | ||
Dumont biology tweezers 5 dumstar polished | FST Fine Science Tools | 11295-10 | ||
Nickel plated pin holder | FST Fine Science Tools | 26018-17 | ||
s.s minutien pins 0.1mm diam, 10mm long | FST Fine Science Tools | 26002-10 | ||
9 well plates 85X100 mm, 22mm o.d.x7mm deep | CORNING | 7220-85 | ||
Stereo Microscope MZ 16.5 with a standard transmitted light base TL ST | Leica | |||
6 well plates | Costar | 3516 | ||
Slides | Menzel Glaser GmbH | 798 | ||
Cover slips | Corning | 2940-223 | ||
Mounting media | Vectashield | H-1200 | ||
Cell strainer | Falcon | FAL352350 | ||
1B1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | |||
Anti-Traffic Jam | Laboratory of Dr. Dorothea Godt | |||
Anti-Vasa | Laboratory of Dr. Ruth Lehmann | |||
Anti β-Galactosidase | Cappel | |||
Secondary Antibodies | Jackson ImmunoResearch |