Summary
Dit artikel beschrijft een weefseltransplantatie techniek die is ontworpen om de signalering en patroonvorming eigenschappen van de oppervlakte Cephalic ectoderm tijdens de craniofaciale ontwikkeling test.
Abstract
De toegankelijkheid van aviaire embryo's heeft geholpen experimentele embryologen begrijpen het lot van cellen tijdens de ontwikkeling en de rol van weefsel interacties die patronen en morfogenese van de gewervelde dieren (bijv. 1, 2, 3, 4) te regelen. Hier, illustreren we een methode die deze toegankelijkheid exploiteert aan de signalering en patroonvorming eigenschappen van de ectodermale weefsels te testen tijdens het gezicht ontwikkeling. In deze experimenten, maken we kwartel-chick 5 of muis-chick 6 hersenschimmen door het transplanteren van het oppervlak cefalische ectoderm dat de bovenkaak van de kwartel of de muis dekt op ofwel de dezelfde regio of een buitenbaarmoederlijke regio van kippenembryo's. Het gebruik van kwartels als donor weefsel voor transplantatie in kuikens werd ontwikkeld om te profiteren van een hergroepering van nucleoli marker aanwezig is in kwartel, maar niet kuiken cellen, waardoor de onderzoekers voor het hosten en de donor weefsels 7 te onderscheiden. Ook een repetitief element aanwezig is in de muis genoom en is alomtegenwoordig uitgedrukt, waardoor we gastheer en donor weefsels te onderscheiden in de muis-chick hersenschimmen 8. Het gebruik van de muis ectoderm als donor weefsel zal sterk uit te breiden ons begrip van deze weefsel interacties, want dit zal ons toelaten om de signalering eigenschappen van ectoderm ontleend aan diverse mutant embryo's te testen.
Protocol
1. De voorbereiding van het donorweefsel
- Bereid cultuur media, scherp glas spelden, scherper wolfraam naalden.
- Verzamel embryo van Shell, wassen in ijskoud PBS.
- Met behulp van een 10 ml spuit en een 18 gauge naald te verwijderen 1,0 ml albumine uit het puntige uiteinde van de eierschaal.
- Maak een klein gaatje aan de bovenzijde van het reservoir met behulp van de punt van de schaar, en sneed een ronde opening aan de embryo bloot
- Verwijder de kop en plaats in DMEM (serum vrij, kamertemperatuur)
- Ontleden Frontonasal Proces van het embryo (of andere donor site, zoals de bovenkaak of onderkaak proces)
- Digest in 2.4U / mL dispase in PBS op ijs gedurende 20 minuten
- Bedek weefsels met DMEM met 1% BSA om de spijsvertering te stoppen
- Gebruik geslepen wolfraam naald te scheiden ectoderm, mesenchym, en neuroectoderm
- Bewaar graft weefsel in DMEM 1% BSA op ijs totdat gastheer klaar is voor transplantatie
2. De voorbereiding van de Host
- Expose het embryo
- Met behulp van een 10 ml spuit en een 18 gauge naald te verwijderen 1,0 ml albumine uit het puntige uiteinde van de eierschaal.
- Maak een klein gaatje aan de bovenzijde van het reservoir met behulp van de punt van de schaar. Leg een stukje tape over het gat, en snijd een ronde opening aan de embryo bloot te leggen.
- Met behulp van twee paar pincet, pak de amnion en voorzichtig scheuren om een gat te maken.
- Draai het hoofd door het plaatsen van een paar pincetten aan de rechter oog en druk uit te oefenen. Houd het hoofd stabiel, gebruik maken van een wolfraam naald aan de gastheer ectoderm verwijderen om het transplantaat te passen.
- Breng de graft aan de gastheer met een glazen pipet.
- Plaats de graft aan de verwijderde ectoderm te vervangen. Plaats een glas speld in elke hoek van de geënte weefsel om het transplantaat pin op zijn plaats. Te maken glas pinnen, trek een microcapillaire buis tot een fijne punt meer dan een alcohol vlam.
- Strak plaats tape over het gat en terug te keren embryo naar de incubator voor de juiste lengte van de tijd voor analyse.
- zie ook: 9
3. Representatieve resultaten:
Voor de beoordeling van hersenschimmen, moeten embryo's worden verzameld en verwerkt voor de analyse van de distributie van gastheer en donor weefsels. Voor de detectie van kwartel cellen, immunohistochemie met behulp van de QcPN antilichaam (zoals beschreven in: 3) wordt gebruikt, en voor de detectie van de muis cellen, in situ hybridisatie op paraffinecoupes wordt gebruikt 6. Donorcellen moet worden beperkt tot het epitheel, en er mag geen bewijs van donor mesenchymale weefsels (figuur 1). De aanwezigheid van geïsoleerde donor cellen in het mesenchym duidt op de aanwezigheid van verontreiniging neurale cellen, die een morfologische interpretatie te wijten aan de invloed van deze cellen op vele aspecten van het gezicht ontwikkeling (bv. 10) zal beschamen. Zodra er van overtuigd dat het transplantaat techniek is vrij van vervuilende mesenchym, verder kan morfologische of moleculaire uitkomstmaten worden gebruikt om de hersenspinsels te beoordelen. Voor ons doel, we ontdekt de aanwezigheid van ectopische kraakbeen en botten die overeenkwam met verdubbelingen van de bovenkaak die werden veroorzaakt door de getransplanteerde weefsels (figuur 2), en moleculaire veranderingen in de mesenchymale weefsels in reactie op de geënte ectoderm (Figuur 3) 5,6.
Figuur 1. Beoordeling van chimerisme (A) Anti-QcPN kleuring wordt gebruikt om cellen te detecteren in de kwartel kwartel-chick hersenschimmen. Er is geen bewijs van kleuring in het mesenchym. (B) In situ hybridisatie wordt gebruikt om de uitdrukking van SINE B2 transcripten detecteren in de muis-chick hersenschimmen. Expression is beperkt tot het ectoderm, bestaande uit het transplantaat.
Figuur 2. Trichroom kleuren toont verdubbeling van de bovenkaak skelet in (A) kwartel-chick chimera, en (B) muis-chick hersenschimmen.
Figuur 3. Het ectoderm regultes genexpressie in het mesenchym. (A) Normaal Bmp7 uitdrukking in het mesenchym van een kippenembryo (radioactieve in situ hybridisatie met een positieve signaal pseudo-rood gekleurd in Adobe Photoshop). (B) Bmp7 expressie wordt geïnduceerd in de mesenchym grenzend aan het transplantaat (pijl) in chimère embryo's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met behulp van deze transplantatie methode heeft ons toegestaan om te bepalen dat het ectoderm signalering informatie die dorsoventral polariteit en proximodistal uitbreiding van de bovenkaak regelt bevat. De gelijkenis van de uitkomsten bij het gebruik van kwartel of de muis ectoderm, en het behoud van de moleculaire signalen in dit weefsel onder veel diersoorten 6,11 geeft aan dat dit een zeer goed geconserveerd signalering centrum onder de gewervelde dieren. Bovendien hebben andere onderzoekers gebruikt soortgelijke technieken om de signalering eigenschappen van de verschillende regio's van het oppervlak Cephalic ectoderm testen en hebben ontdekt de aanwezigheid van meerdere signalering centra gelegen in het ectoderm die bijdragen aan morfogenese van het gezicht 12. Deze methode laat ons toe om verder ons begrip van de rol die verschillende weefsels, evenals de regionale verschillen binnen weefsels, spelen tijdens het gezicht ontwikkeling. Tot slot, door het combineren van de kracht van genetica bij muizen met de kracht van het aviaire-hersenschim systeem zullen we in staat om de moleculaire mediatoren van de epitheliale-mesenchymale interacties tijdens de ontwikkeling toe te lichten, en we zullen in staat zijn om de mechanismen waarmee deze interacties te identificeren reguleren ontwikkeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door R01-R01-DE018234 en DE019638.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Tektronix, Inc. | TEKZR114 | |
| DMEM | University of California - San Francisco | CCFDA003 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dispase | GIBCO, by Life Technologies | 17105-041 | |
| 35x10 mm Petri dish | Falcon BD | 1008 | |
| No. 5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Tungsten Needle | Fine Science Tools | 26000 | |
| Microcapillary tube | Drummond Scientific | 3-000-225-G | |
| Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Blade holder | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| Razor blade | Fine Science Tools | 10050-00 |
References
- Noden, D. M. The Role of the Neural Crest in Patterning of Avian Cranial Skeletal, Connective, and Muscle Tissues. Developmental Biology. 96, 144-144 (1983).
- Bronner-Fraser, M., Stern, C. Effects of Mesodermal Tissues on Avian Neural Crest Cell Migration. Developmental Biology. 143, 213-213 (1991).
- Schneider, R. A. Neural crest can form cartilages normally derived from mesoderm during development of the avian head skeleton. Developmental Biology. 208, 441-441 (1999).
- Couly, G. Interactions between Hox-negative cephalic neural crest cells and the foregut endoderm in patterning the facial skeleton in the vertebrate head. Development. 129, 1061-1061 (2002).
- Evans, D. J., Noden, D. M. Spatial relations between avian craniofacial neural crest and paraxial mesoderm cells. Dev Dyn. , (2006).
- Hu, D., Marcucio, R., Helms, J. A. A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face. Development. 130, 1749-1749 (2003).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals. Dev Biol. 325, 200-200 (2009).
- Le Lièvre, C. S., Le Douarin, N. M. Mesenchymal derivatives of the neural crest: analysis of chimaeric quail and chick embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 34, 125-125 (1975).
- Bollag, R. J. Use of a repetitive mouse B2 element to identify transplanted mouse cells in mouse-chick chimeras. Exp Cell Res. 248, 75-75 (1999).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp. , (2007).
- Eames, B. F., Schneider, R. A. Quail-duck chimeras reveal spatiotemporal plasticity in molecular and histogenic programs of cranial feather development. Development. 132, 1499-1499 (2005).
- Odent, S. Expression of the Sonic hedgehog (SHH ) gene during early human development and phenotypic expression of new mutations causing holoprosencephaly. Hum Mol Genet. 8, 1683-1683 (1999).
- Szabo-Rogers, H. L. Novel skeletogenic patterning roles for the olfactory pit. Development. 136, 219-219 (2009).
