Een eenvoudige en efficiënte methode te transformeren<em> Physcomitrella pantens</em> Protoplasten is beschreven. Deze methode is een bewerking van protocollen voor<em> Physocmitrella</em> Protonemal protoplast en<em> Arabidopsis</em> Bladmoes protoplast transformatie<sup> 1</sup>.
De methode hier gepresenteerde maakt een eenvoudige en consistente DNA transformatie in Physcomitrella patens protoplasten. Deze methode werd oorspronkelijk ontwikkeld voor Arabidopsis 1, maar hier hebben we aangetoond dat het goed presteert met protoplasten van Physcomitrella patens, een eenvoudiger en andere planten. Daarom kan deze methode worden toegepast op andere plantensoorten met kleine aanpassingen. Eventuele wijzigingen voor optimalisatie zijn protoplastfusie concentratie in MMG, incubatie tijd in MMG en PEG / Ca-oplossing. Kiezen we ervoor om 60 ug DNA gebruiken in onze routine experimenten, omdat het aantal transformanten lineair toeneemt met de DNA-concentratie tot dit punt (tabel 1). We konden krijgen ongeveer 7000 voorbijgaande transformanten of 200 stabiel transformanten op een enkel 60 ug DNA transformatie, die het mogelijk maakt voor verdere screening en analyse van een grote populatie van planten.
De getransformeerde protoplasten kan verspreiden met vloeibare plating medium of PRM-T worden. Hoewel de regeneratie rendement is lager als vloeibaar plating medium wordt gebruikt, kiezen we voor deze methode als de protoplasten werden getransformeerd met plasmiden dubbele helix. Zoals getoond in tabel 1, transformaties gedaan met helix plasmide DNA te genereren transformanten veel meer en dus kunnen we nog steeds grote aantallen van planten te verkrijgen met vloeibaar plating medium. Bovendien, het verspreiden van protoplasten met vloeibare plating medium kan er sneller herstel, wat belangrijk is voor experimenten met voorbijgaande fenotypes, zoals RNAi knock down experimenten 9,15. Naast de afwezigheid van de top agar zorgt voor makkelijke plant isolatie voor immunokleuring en RT-PCR 9,15.
The authors have nothing to disclose.
LV wordt ondersteund door de NSF (IOS 1002837)
Name of the reagent | Ingredient |
PPNH4 | 1.84 mM KH2PO4 3.4 mM Ca(NO3)2 1 mM MgSO4 2.72 mM Diammonium tartrate 54 μM FeSO4.7H2O 9.93 μM H3BO3 1.97 μM MnCl2.4H2O 0.23 μM CoCl2.6H2O 0.19 μM ZnSO4. 7H2O 0.22 μM CuSO4. 5H2O 0.10 μM Na2MoO4.2H2O 0.168 μM KI Add 0.7% agar for solid medium. |
PRM-B | PPNH4 with 6% mannitol and 0.8% agar. Add 10 mL 1M CaCl2 to 1 L before pouring plates. |
PRM-T | PPNH4 with 6% mannitol and 0.6% agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use. |
Liquid Plating Medium | PPNH4 with 8.5% mannitol without agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use. |
2% Driselase | Add 4 g of Driselase (Sigma D9515-25G) to 200 mL of 8% mannitol. Stir gently for 30 min. at room temperature, incubate 30 min. at 4°C, and stir gently for 5 min. at room temperature. Spin 2,500 g for 10 min, discard pellet. Filter with 0.22 μm, and store frozen as 10 mL aliquots. Thaw in a room temperature water bath before use. |
MMg | 0.4 M mannitol 15 mM MgCl2 4 mM MES (pH 5.7) |
PEG/Ca | 4 g PEG4000 3 mL H2O 2.5 mL 0.8 M mannitol 1 mL 1M CaCl2 |
W5 | 154 mM NaCl 125 mM CaCl2 5 mM KCl 2 mM MES (pH 5.7) |