Un metodo semplice ed efficace per trasformare<em> Physcomitrella pantens</em> Protoplasti è descritto. Questo metodo è adattato da protocolli per<em> Physocmitrella</em> Protonemal protoplasti e<em> Arabidopsis</em> Mesofillo trasformazione di protoplasti<sup> 1</sup>.
Il metodo presentato qui permette una trasformazione del DNA lineare e coerente in Physcomitrella protoplasti patene. Questo metodo è stato originariamente sviluppato per Arabidopsis 1, ma qui abbiamo dimostrato che si comporta bene con protoplasti di Physcomitrella patene, un impianto più semplice e diverso. Pertanto, questo metodo può essere applicato ad altre specie di piante, con piccole modifiche. Possibili modifiche per l'ottimizzazione comprendono concentrazione di protoplasti in MMG, tempo di incubazione in soluzione MMG e PEG / Ca. Abbiamo scelto di utilizzare il DNA 60 mg nei nostri esperimenti di routine perché il numero di trasformanti cresce linearmente con la concentrazione di DNA fino a questo punto (Tabella 1). Potremmo avere circa 7000 trasformanti transitori o 200 trasformanti stabili su un singolo 60 mcg trasformazione del DNA, che permette per lo screening e analisi di una vasta popolazione di piante.
Il protoplasti trasformato può essere diffuso con il mezzo liquido o placcatura PRM-T. Sebbene l'efficienza di rigenerazione è più bassa quando medie placcatura liquida è utilizzato, abbiamo scelto questo metodo quando il protoplasti sono stati trasformati con plasmidi superavvolto. Come mostrato nella tabella 1, le trasformazioni fatto con superavvolto DNA plasmidico generare trasformanti molti altri e, quindi, possiamo ancora ottenere un gran numero di impianti di media placcatura liquido. Inoltre, la diffusione protoplasti con placcatura medio liquido permette una più veloce rigenerazione, che è importante per gli esperimenti che coinvolgono fenotipi transitoria, come RNAi abbattere esperimenti 9,15. Inoltre l'assenza di agar in alto permette di isolamento pianta facile per immunoistochimica e RT-PCR 9,15.
The authors have nothing to disclose.
LV è supportato dalla NSF (IOS 1002837)
Name of the reagent | Ingredient |
PPNH4 | 1.84 mM KH2PO4 3.4 mM Ca(NO3)2 1 mM MgSO4 2.72 mM Diammonium tartrate 54 μM FeSO4.7H2O 9.93 μM H3BO3 1.97 μM MnCl2.4H2O 0.23 μM CoCl2.6H2O 0.19 μM ZnSO4. 7H2O 0.22 μM CuSO4. 5H2O 0.10 μM Na2MoO4.2H2O 0.168 μM KI Add 0.7% agar for solid medium. |
PRM-B | PPNH4 with 6% mannitol and 0.8% agar. Add 10 mL 1M CaCl2 to 1 L before pouring plates. |
PRM-T | PPNH4 with 6% mannitol and 0.6% agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use. |
Liquid Plating Medium | PPNH4 with 8.5% mannitol without agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use. |
2% Driselase | Add 4 g of Driselase (Sigma D9515-25G) to 200 mL of 8% mannitol. Stir gently for 30 min. at room temperature, incubate 30 min. at 4°C, and stir gently for 5 min. at room temperature. Spin 2,500 g for 10 min, discard pellet. Filter with 0.22 μm, and store frozen as 10 mL aliquots. Thaw in a room temperature water bath before use. |
MMg | 0.4 M mannitol 15 mM MgCl2 4 mM MES (pH 5.7) |
PEG/Ca | 4 g PEG4000 3 mL H2O 2.5 mL 0.8 M mannitol 1 mL 1M CaCl2 |
W5 | 154 mM NaCl 125 mM CaCl2 5 mM KCl 2 mM MES (pH 5.7) |