Eine einfache und effiziente Methode zur Umwandlung<em> Physcomitrella pantens</em> Protoplasten beschrieben. Diese Methode wird von Protokollen für angepasste<em> Physocmitrella</em> Protonema Protoplasten und<em> Arabidopsis</em> Mesophyll Protoplasten-Transformation<sup> 1</sup>.
Die hier vorgestellte Methode ermöglicht eine einfache und konsistente DNA-Transformation in Physcomitrella patens Protoplasten. Diese Methode wurde ursprünglich für Arabidopsis 1 entwickelt, aber hier haben wir gezeigt, dass es gut funktioniert mit Protoplasten von Physcomitrella patens, eine einfachere und verschiedene Pflanzenarten. Daher kann diese Methode auf andere Pflanzenarten mit geringfügigen Änderungen angewendet werden. Mögliche Modifikationen zur Optimierung gehören Protoplastenkonzentration in der MMG, Inkubationszeit in MMG und PEG / Ca-Lösung. Wir entscheiden uns für 60 ug DNA in unseren Routineversuche zu verwenden, da die Zahl der Transformanten steigt linear mit der DNA-Konzentration bis zu diesem Zeitpunkt (Tabelle 1). Wir konnten etwa 7000 transiente Transformanten oder 200 stabile Transformanten auf einer einzigen 60 ug DNA-Transformation, die zur weiteren Überprüfung und Analyse einer großen Population von Pflanzen ermöglicht.
Die transformierten Protoplasten können entweder verteilt mit Flüssigkeit plating Medium oder PRM-T werden. Obwohl die Regeneration Wirkungsgrad ist niedriger, wenn flüssige Beschichtung Medium verwendet wird, wählen wir diese Methode, wenn die Protoplasten mit supercoiled Plasmiden transformiert wurden. Da zeigten die in Tabelle 1, erzeugen Transformationen mit supercoiled Plasmid-DNA erfolgt viel mehr Transformanten und somit können wir immer noch erhalten eine große Anzahl von Anlagen mit flüssigen Beschichtung Medium. Darüber hinaus verbreiten Protoplasten mit flüssigen Beschichtung Medium ermöglicht eine schnellere Regeneration, was wichtig ist für Experimente, die transiente Phänotypen, wie RNAi knock down Experimenten 9,15. Neben dem Fehlen von Top-Agar ermöglicht eine einfache Anlage Trennung für Immunfärbung und RT-PCR 9,15.
The authors have nothing to disclose.
LV wird durch NSF (IOS 1002837) unterstützt
Name of the reagent | Ingredient |
PPNH4 | 1.84 mM KH2PO4 3.4 mM Ca(NO3)2 1 mM MgSO4 2.72 mM Diammonium tartrate 54 μM FeSO4.7H2O 9.93 μM H3BO3 1.97 μM MnCl2.4H2O 0.23 μM CoCl2.6H2O 0.19 μM ZnSO4. 7H2O 0.22 μM CuSO4. 5H2O 0.10 μM Na2MoO4.2H2O 0.168 μM KI Add 0.7% agar for solid medium. |
PRM-B | PPNH4 with 6% mannitol and 0.8% agar. Add 10 mL 1M CaCl2 to 1 L before pouring plates. |
PRM-T | PPNH4 with 6% mannitol and 0.6% agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use. |
Liquid Plating Medium | PPNH4 with 8.5% mannitol without agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use. |
2% Driselase | Add 4 g of Driselase (Sigma D9515-25G) to 200 mL of 8% mannitol. Stir gently for 30 min. at room temperature, incubate 30 min. at 4°C, and stir gently for 5 min. at room temperature. Spin 2,500 g for 10 min, discard pellet. Filter with 0.22 μm, and store frozen as 10 mL aliquots. Thaw in a room temperature water bath before use. |
MMg | 0.4 M mannitol 15 mM MgCl2 4 mM MES (pH 5.7) |
PEG/Ca | 4 g PEG4000 3 mL H2O 2.5 mL 0.8 M mannitol 1 mL 1M CaCl2 |
W5 | 154 mM NaCl 125 mM CaCl2 5 mM KCl 2 mM MES (pH 5.7) |